GB/T 45202-2025 牛体外胚胎生产和移植技术规程

ICS65.020.30
CCS B43
中华人民共和国国家标准
GB/T45202—2025
牛体外胚胎生产和移植技术规程
Codeofpracticeforinvitroembryoproductionandtransferincattle
2025-01-24发布2025-08-01实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发布

前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。
本文件起草单位:西北农林科技大学、内蒙古大学、天津力牧生物科技有限公司、内蒙古赛科星繁育
生物技术(集团)股份有限公司。
本文件主要起草人:张涌、刘军、张景程、李光鹏、王勇胜、李喜和、孙伟、张立、郝少强、王娜。
Ⅰ
GB/T45202—2025

牛体外胚胎生产和移植技术规程
1 范围
本文件确立了牛体外胚胎生产和移植过程中的操作流程,规定了体外胚胎生产的基本要求、供体的
选择与处理、卵母细胞采集、体外成熟、体外受精、体外培养、胚胎冷冻与解冻、胚胎移植与妊娠检查技术
要求,描述了证实方法。
本文件适用于牛体外胚胎生产和移植。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T25881 牛胚胎
GB/T26938 牛体内胚胎生产与移植技术规程
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
GB/T25881和GB/T26938界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
卵丘-卵母细胞复合体 cumulus-oocytecomplexes;COCs
卵丘细胞包裹卵母细胞形成的复合体。
3.1.2
体外成熟 invitro maturation;IVM
COCs在体外适宜条件下培养,使卵母细胞发育成熟,排出第一极体并具有受精能力的过程。
3.1.3
精子纯化 spermpurification
从精液中分离获得活精子的操作过程。
3.1.4
体外受精 invitrofertilization;IVF
精子和成熟卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。
3.1.5
体外培养 invitroculture;IVC
受精卵在体外适宜环境下培养的过程。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
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BLR:囊胚率(blastocystrate)
CLR:卵裂率(cleavagerate)
CR:产犊率(calvingrate)
FSH:促卵泡素(follicle-stimulatinghormone)
OPU:活体采卵(ovumpick-up)
PR:妊娠率(pregnancyrate)
4 技术流程
见图1。
图1 牛体外胚胎生产和移植技术流程图
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5 基本要求
5.1 设施设备
宜配备:
a) 设施:百万级以上洁净实验室;
b) 仪器设备:活体采卵仪、体视显微镜、离心机、精子密度测定仪、CO2 培养箱、三气培养箱、恒温
台、水浴锅。
5.2 培养条件
卵母细胞体外成熟和体外受精应在38.5℃、5%(体积分数)CO2 空气和饱和湿度下培养;体外胚胎
应在38.5℃、5%(体积分数)CO2、7%(体积分数)O2、88%(体积分数)N2 和饱和湿度下培养。
5.3 试剂
5.3.1 化学试剂纯度应达到细胞或胚胎培养级别的要求。
5.3.2 试验用水应符合GB/T6682二级水的要求,电阻率达到18.2MΩ·cm(25℃)。
6 供体的选择与处理
6.1 供体的选择
供体应满足以下条件。
a) 符合本品种标准,遗传性能稳定,种用价值高,三代系谱清楚。
b) 生殖器官和卵巢机能正常。
c) OPU青年牛宜为10月龄以上,经产牛宜产后40d以上;体况适中,评分宜2.75以上(5分制)。
d) 无遗传缺陷病和传染病。
6.2 供体的处理
6.2.1 非超排处理
利用活体采卵仪直接采卵,宜间隔3d~4d采集一次。
6.2.2 超排处理
供体超排处理程序如下:
a) 第0天用活体采卵仪检查卵巢,宜刺破直径(ϕ)>5mm 的卵泡;
b) 第2天和第3天间隔12h各注射一次FSH,可根据FSH 制剂活性、供体品种和体况确定
FSH 适宜剂量;
c) 第5天进行OPU;
d) 重复超排处理间隔宜大于14d。
7 卵母细胞采集
7.1 供体屠宰后卵巢卵母细胞的采集
供体屠宰后的新鲜卵巢置于20 ℃~25 ℃含有抗生素的生理盐水中,6h内运输到实验室。用
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30℃~37℃预热的生理盐水清洗3次~4次。一次性注射器或真空负压泵连接21G 针头,针口向下
刺入ϕ2mm~8mm 的卵泡,吸取卵泡液和COCs,移到细胞培养皿中,置于38.5℃恒温台上,体视显微
镜下收集COCs,转移到预热38.5℃的采卵液(见附录A 中A.1)中。
7.2 活体采卵
7.2.1 采卵前准备
保定供体,清除直肠宿粪,硬膜外麻醉,清洗、消毒会阴部及外阴;50mL离心管与负压泵和采卵针
连接,置于恒温槽上;吸取少量采卵液润洗采卵管。
7.2.2 采卵过程
供体采卵过程如下:
a) 操作人员一只手将活体采卵仪超声波探头插入供体阴道至穹隆处,另一只手通过直肠把握将
一侧卵巢隔着阴道穹隆壁紧贴超声波探头;
b) 调整超声波探头与卵巢的相对位置,使卵泡位于进针线上,开启真空泵并推进采卵针穿刺卵
泡,采集卵泡液和COCs;
c) 采集所有ϕ2mm~8mm 卵泡后,冲洗采卵针及采卵管,使COCs进入离心管;
d) 采用同样的方法对另一侧卵巢进行COCs采集;
e) 如有血液阻塞采卵针或采卵管,应将采卵针撤出并提高负压,吸取采卵液以疏通采卵针和采
卵管;
f) 将采集的卵泡液和COCs转移到集卵杯过滤液体,置于38.5 ℃恒温台上,体视显微镜下收集
COCs,转移到预热38.5℃的采卵液中。
8 体外成熟
8.1 成熟液微滴的准备
在细胞培养皿中制作100μL的成熟培养液(见A.2)微滴,用矿物油覆盖,CO2 培养箱中平衡2h
以上。
8.2 COCs的分级
体视显微镜下按形态学方法将COCs分为如下4个级别。
a) A 级:卵母细胞胞质均匀,包裹5层以上完整而致密的卵丘细胞。A 级卵母细胞图见附录B中
图B.1a)。
b) B级:卵母细胞胞质均匀,包裹3层~5层的卵丘细胞。B级卵母细胞图见图B.1b)。
c) C级:卵母细胞胞质均匀或不均匀,包裹1层~3层卵丘细胞。C级卵母细胞图见图B.1c)。
d) D级:卵丘细胞已经松散或几乎是裸卵。D级卵母细胞图见图B.1d)。
8.3 COCs的培养
挑选A 级、B级和C级COCs,采卵液中清洗3次,用平衡的成熟培养液清洗3次,移入成熟培养液
微滴中,每头供体的COCs应单独培养,每个微滴宜10个~20个COCs,置于CO2 培养箱中培养。
9 体外受精
9.1 受精液微滴的准备
在细胞培养皿中制作90μL体外受精液(见A.3)微滴,用矿物油覆盖,CO2 培养箱中平衡2h以上。
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9.2 卵母细胞的准备
COCs体外成熟培养20h~22h后,用洗涤液(见A.4)洗3次,转移到体外受精液微滴中洗3次,置
于体外受精液微滴中,每个微滴宜培养10个~20个COCs。
9.3 精子的准备
精子的准备可选择下列方法之一。
a) 离心法:吸取1.5mL90%密度梯度离心液(见A.5.1)置于离心管中,再吸取1.5mL45%密度
梯度离心液(见A.5.2)小心置于上层,避免摇动;将37℃水浴解冻的细管精液缓慢加到密度梯
度离心液顶部,1350r/min(200g,离心机ϕ 为20cm)离心10min;吸取底部的精液,加入
1mL洗涤液重悬精子,1350r/min(200g,离心机ϕ 为20cm)离心5min后弃上清,加入洗涤
液重悬精子,精子密度宜调整至1.9×107 个/mL,放回CO2 培养箱中待用。
b) 上浮法:37℃水浴解冻细管精液,缓慢加入至含5mL精子上浮液(见A.6)离心管底部,倾斜
45°放入CO2 培养箱中,静置30min~40min;吸取上清液3mL~4mL,1350r/min(200g,
离心机ϕ 为20cm)离心5min后弃上清,加入洗涤液重悬精子,精子密度宜调整至1.9×107 个/
mL,放回CO2 培养箱中待用。
9.4 受精
取5μL的重悬精子液加入含有COCs的受精液微滴中,CO2 培养箱中共孵育12h~15h。
10 体外培养
10.1 培养液微滴的准备
在细胞培养皿中制作50μL胚胎体外培养液(见A.7)微滴,用矿物油覆盖,CO2 培养箱中平衡2h
以上。
10.2 体外培养
受精培养后将COCs移入透明质酸酶工作液(见A.8)中,用吸管反复轻轻抽吸,去除卵丘细胞及黏
附的精子,用胚胎体外培养液洗3次,移入胚胎体外培养液微滴中,在三气培养箱中培养,每个微滴宜培
养10枚~20枚胚胎。
10.3 胚胎质量鉴定
按照GB/T25881的规定执行。
11 胚胎冷冻与解冻
11.1 冷冻
可选择如下冷冻方法之一进行冷冻:
a) 程序化冷冻方法:按照GB/T26938的规定执行;
b) 玻璃化冷冻方法:将受精后第6天或第7天的可用胚胎移入玻璃化冷冻液1(见A.9.1)中平衡
30s,再移入玻璃化冷冻液2(见A.9.2)中平衡30s,立即将胚胎置于冷冻载杆上,投入液氮。
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11.2 解冻
采用如下解冻方法:
a) 程序化冷冻胚胎的解冻:按照GB/T26938的规定执行;
b) 玻璃化冷冻胚胎的解冻:将冷冻胚胎的载杆从液氮中取出,立即放入预热38.5 ℃的玻璃化解
冻液1(见A.9.3)中平衡1min,再移入玻璃化解冻液2(见A.9.4)中平衡5min,在胚胎培养液
中洗3次。
12 胚胎移植与妊娠检查
按照GB/T26938的规定执行。
13 证实方法
13.1 过程记录
查验各环节的记录表、照片、影像材料等。记录表应包括采卵记录表、体外受精记录表、胚胎冷冻解
冻记录表和胚胎移植记录表,见附录C。
13.2 胚胎发育率
包括卵裂率和囊胚率,计算公式如下。
a) 卵裂率按式(1)计算。
CLR=
n1
n2
×100% …………………………(1)
式中:
CLR———卵裂率;
n1 ———卵裂胚胎的数值,单位为个;
n2 ———COCs的数值,单位为个。
b) 囊胚率按式(2)计算。
BLR=
n3
n2
×100% …………………………(2)
式中:
BLR———囊胚率;
n3 ———囊胚的数值,单位为个;
n2 ———COCs的数值,单位为个。
13.3 妊娠率
胚胎移植后宜45d~60d孕检,妊娠率按公式(3)计算。
PR=
n4
n5
×100% …………………………(3)
式中:
PR———妊娠率;
n4 ———妊娠受体的数值,单位为头;
n5 ———移植受体的数值,单位为头。
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13.4 产犊率
产犊率按公式(4)计算。
BR=
n6
n5
×100% …………………………(4)
式中:
BR———产犊率;
n6 ———出生犊牛受体的数值,单位为头;
n5 ———移植受体的数值,单位为头。
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附 录 A
(资料性)
液体配制
A.1 采卵液
采卵液配方见表A.1。各成分用超纯水溶解后定容至1L,渗透压为290mOsm/kg~310mOsm/kg,
调整pH 至7.2~7.4,用0.22μm滤膜过滤,4℃保存(不超过2个月)。
表A.1 采卵液配方
成分含量
聚乙烯醇/(g/L) 0.1
氯化钠/(g/L) 6.663
氯化钾/(g/L) 0.237
磷酸二氢钠/(g/L) 0.041
碳酸氢钠/(g/L) 0.168
4-羟乙基哌嗪乙磺酸/(g/L) 2.383
D-山梨醇/(g/L) 2.186
丙酮酸钠/(g/L) 0.022
60%乳酸钠溶液/(mL/L) 1.868
青霉素/U 100000
庆大霉素/(g/L) 0.025
六水氯化镁/(g/L) 0.102
二水氯化钙/(g/L) 0.294
肝素钠/(g/L) 0.1
注:液体配制中各溶液的渗透压单位为mOsm/kg。根据范特荷甫公式将其换算为渗透压的国际单位帕斯卡(Pa)。
π =i×C ×R ×T
式中:
π ———渗透压,单位为帕斯卡(Pa);
i ———溶质的离子化系数(对于非电解质,i=1);
C ———溶质的浓度,单位为摩尔每升(mol/L),1mOsm/kg=1mmol/L;
R ———气体常数,R≈8.314J/(mol·K);
T ———绝对温度,单位为开尔文(K),室温(25℃)T =298.15K。
A.2 成熟培养液
成熟培养液配方见表A.2。各成分用TCM199溶解后定容至1L,渗透压为290 mOsm/kg~
310mOsm/kg,调整pH 至7.2~7.4,用0.22μm 滤膜过滤,4℃保存(不超过1个月)。
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表A.2 成熟培养液配方
成分含量
胎牛血清/(mL/L) 100
丙酮酸钠/(g/L) 0.02
表皮生长因子/(g/L) 0.00005
L-丙氨酰-L-谷氨酷胺二肽(100×)/(mL/L) 1.7
半胱胺酸/(g/L) 0.069
17β-雌二醇/(g/L) 0.002
促卵泡素/U 20
促黄体素/U 20
庆大霉素/(g/L) 0.0125
A.3 体外受精液
体外受精液配方见表A.3。各成分用超纯水溶解后定容至1L,渗透压为275 mOsm/kg~
295mOsm/kg,调整pH 至7.2~7.4,用0.22μm 滤膜过滤,4℃避光保存(不超过2周)。
表A.3 体外受精液配方
成分含量
氯化钠/(g/L) 6.29
氯化钾/(g/L) 0.53
磷酸二氢钾/(g/L) 0.16
六水氯化镁/(g/L) 0.1
碳酸氢钠/(g/L) 2.11
丙酮酸钠/(g/L) 0.04
二水氯化钙/(g/L) 0.17
庆大霉素/(g/L) 0.0125
柠檬酸钠/(g/L) 0.15
L-丙氨酰-L-谷氨酷胺二肽(100×)/(mL/L) 10
必需氨基酸/(mL/L) 20
非必需氨基酸/(mL/L) 10
60%乳酸钠溶液/(mL/L) 0.7755
牛血清白蛋白(不含脂肪酸)/(g/L) 8.0
肝素钠/(g/L) 0.02
阿米卡星/(g/L) 0.025
亚牛磺酸/(g/L) 0.0011
D-青霉胺/(g/L) 0.003
肾上腺素/(g/L) 0.00045
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A.4 洗涤液
洗涤液配方见表A.4,各成分用超纯水溶解后定容至1L,渗透压为260mOsm/kg~270mOsm/kg,调
整pH 至7.2~7.4,用0.22μm滤膜过滤后,4℃避光保存(不超过2周)。
表A.4 洗涤液配方
成分含量
氯化钠/(g/L) 6.67
氯化钾/(g/L) 0.24
六水氯化钾/(g/L) 0.1
碳酸氢钠/(g/L) 0.17
磷酸二氢钠/(g/L) 0.05
丙酮酸钠/(g/L) 0.02
二水氯化钙/(g/L) 0.29
60%乳酸钠溶液/(mL/L) 1.416
4-羟乙基哌嗪乙磺酸/(g/L) 2.384
庆大霉素/(g/L) 0.0125
牛血清白蛋白(不含脂肪酸)/(g/L) 6.0
阿米卡星/(g/L) 0.025
A.5 胚胎体外培养液
A.5.1 90%密度梯度离心液:根据表A.4配成10倍浓度的洗涤液,取10mL10倍浓度的洗涤液,加入
90mLPercoll(聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液)中混匀。
A.5.2 45%密度梯度离心液:取1.5mL90%密度梯度离心液,加入1.5mL 洗涤液中混匀。
A.6 精子上浮液
精子上浮液配方见表A.5。各成分用超纯水溶解后定容至1L,渗透压为275 mOsm/kg~
295mOsm/kg,调整pH 至7.2~7.4,用0.22μm 滤膜过滤后,4℃避光保存(不超过2周)。
表A.5 精子上浮液配方
成分含量
氯化钠/(g/L) 6.29
氯化钾/(g/L) 0.53
磷酸二氢钾/(g/L) 0.16
六水氯化镁/(g/L) 0.10
碳酸氢钠/(g/L) 2.11
丙酮酸钠/(g/L) 0.03
二水氯化钙/(g/L) 0.17
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表A.5 精子上浮液配方(续)
成分含量
L-丙氨酰-L-谷氨酷胺二肽(100×)/(mL/L) 10
60%乳酸钠溶液/(mL/L) 0.7755
柠檬酸钠/(g/L) 0.15
非必需氨基酸/(mL/L) 10
庆大霉素/(g/L) 0.0125
牛血清白蛋白(不含脂肪酸)/(g/L) 6.0
肝素钠/(g/L) 2.0
阿米卡星/(g/L) 0.025
A.7 胚胎体外培养液
胚胎体外培养液配方见表A.6,各成分用超纯水溶解后定容至1L,渗透压为272 mOsm/kg~
288mOsm/kg,调整pH 至7.2~7.4,用0.22μm 滤膜过滤后,4℃避光保存(不超过1个月)。
表A.6 胚胎体外培养液配方
成分用量
氯化钠/(g/L) 6.29
氯化钾/(g/L) 0.53
磷酸二氢钾/(g/L) 0.16
六水氯化钙/(g/L) 0.10
L-丙氨酰-L-谷氨酷胺二肽(100×)/(mL/L) 10
二水氯化钙/(g/L) 0.17
碳酸氢钠/(g/L) 2.11
60%乳酸钠溶液/(mL/L) 0.7755
柠檬酸钠/(g/L) 0.15
丙酮酸钠/(g/L) 0.04
肌醇/(g/L) 0.5
必需氨基酸/(mL/L) 20
非必需氨基酸/(mL/L) 10
庆大霉素/(g/L) 0.0125
牛血清白蛋白(不含脂肪酸)/(g/L) 6.0
A.8 透明质酸酶工作液
透明质酸酶工作液配方见表A.7。各成分用含4-羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199溶解后定容至
1L,渗透压为272mOsm/kg~290mOsm/kg,调整pH 至7.2~7.4,用0.22μm 滤膜过滤,-20℃保存
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(不超过1年)。
表A.7 透明质酸酶工作液
成分用量
透明质酸酶/(g/L) 1.0
牛血清白蛋白(不含脂肪酸)/(g/L) 3.0
丙酮酸钠/(g/L) 0.04
L-丙氨酰-L-谷氨酷胺二肽(100×)/(mL/L) 1.7
A.9 胚胎玻璃化冷冻液
A.9.1 玻璃化冷冻液1:70mL含4-羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199中加入12.04g蔗糖、10mL胎牛血
清、10mL二甲基亚砜和10mL乙二醇,充分混匀后,用0.22μm 滤膜过滤,再加入21.0mg聚蔗糖,
4℃避光保存(不超过6个月)。
A.9.2 玻璃化冷冻液2:50mL 含4-羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199中加入8.6g蔗糖、20mL胎牛血
清、15mL 二甲基亚砜和15mL乙二醇,充分混匀后,用0.22μm 滤膜过滤,再加入15.0mg聚蔗糖,
4℃避光保存(不超过6个月)。
A.9.3 玻璃化解冻液1:100mL 含4-羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199中加入8.6g蔗糖,用0.22μm 滤
膜过滤,4℃避光保存(不超过4周)。
A.9.4 玻璃化解冻液2:100mL 含4-羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199中加入5.1g蔗糖,用0.22μm 滤
膜过滤,4℃避光保存(不超过4周)。
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附 录 B
(资料性)
不同级别COCs图片
不同级别COCs图片见图B.1。
a) A 级COCs b) B级COCs
c) C级COCs d) D 级COCs
图B.1 不同级别COCs图片
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附 录 C
(资料性)
记录表
C.1 采卵记录表
采卵记录表见表C.1。
表C.1 采卵记录表
时间: 编号:
供体牛号牛场卵泡数采卵人姓名采集COCs数COCs分级
A级B级C级D级
统计人签字
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C.2 体外受精记录表
体外受精记录表见表C.2。
表C.2 体外受精记录表
时间: 编号:
供体牛号体外受精COCs数种公牛号卵裂数
桑葚胚分级和数量囊胚分级和数量
A级B级C级A级B级C级
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C.3 胚胎冷冻解冻记录表
胚胎冷冻解冻记录表见表C.3。
表C.3 胚胎冷冻解冻记录表
时间: 编号:
供体牛号冷冻胚胎数解冻胚胎数解冻后恢复胚胎数可移植胚胎数
C.4 胚胎移植记录表
胚胎移植记录表见表C.4。
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表C.4 胚胎移植记录表
时间: 编号:
受体
牛号
品种
同期发
情方式
发情
时间
黄体
等级
移植
时间
移植侧
供体
牛号
胚胎
类型
胚胎发
育阶段
和等级
受体牛
状态
移植
操作
情况
移植人
孕检
结果
孕检人
流产日期
和孕龄
预产期
产犊
情况
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
左□
右□
鲜胚□
冻胚□
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