T/CSTM 00995-2024 T/CAIA SHO22-2024 人全血糖化血红蛋白HbA1C 含量基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法

ICS 11.020
CCS C 50
团体标准
T/CSTM 00995—2024
T/CAIA SHO22—2024/(IDT)
人全血糖化血红蛋白HbA1C 含量基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法
Human whole blood — Content of glycosylated hemoglobin HbA1C— Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry
2024-10-31 发布2025-01-31 实施
中关村材料试验技术联盟
中国分析测试协会发布

前 言
本文件参照GB/T 1.1—2020 《标准化工作导则第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》，GB/T
20001.4-2015《标准编写规则第4 部分：试验方法标准》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
T/CSTM 00995-2024 与T/CAIA SHO22—2024 一致程度为等同（IDT）。
本文件由中国材料与试验标准化委员会科学试验标准化领域委员会（CSTM/FC98）和中国分析测
试协会共同提出。
本文件由中国材料与试验标准化委员会科学试验领域科学试验创新方法标准化技术委员会
（CSTM/FC98/TC02）和中国分析测试协会共同归口。
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引 言
HbA1C 占总糖化血红蛋白的60%-85%，是糖化血红蛋白的主要组成成分，系2 型糖尿病的临床辅
助诊断及监测指标。HbA1C 由葡萄糖的游离醛基与血红蛋白的β链N 末端缬氨酸的氨基经非酶促结合反
应，先形成不稳定的醛亚胺（Schiff 碱），然后经过葡糖胺重排，最后形成稳定的酮胺化合物。HbA1C
的含量主要取决于血糖浓度及血糖与血红蛋白的接触时间，可以反映采血前120 天内的平均血糖水平，
个体内生物学变异小于2%。
本文件规定的方法直接检测β珠蛋白及糖基化修饰β珠蛋白，无需蛋白内切酶Glu-C 酶切等实验步
骤。所测标志物与国际临床化学和实验室医学联盟（International Federation of Clinical Chemistry and
Laboratory Medicine, IFCC）对糖化血红蛋白HbA1C 含量检测的定义相同，并且能有效地区分和识别多
种血红蛋白变体。
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人全血糖化血红蛋白HbA1C 含量基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法
重要提示：使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有可能的安全问
题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。
1 范围
本文件规定了利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测人全血糖化血红蛋白HbA1C 含量的方
法，包括试剂配制、样品制备、仪器检测、数据分析等。
本文件适用于临床实验室及从事流行病学研究的实验室，对新鲜或冷冻人全血糖化血红蛋白HbA1C
含量的检测（NGSP），线性范围为3.45%~19.50%。其他用途也可参照使用。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第1 部分：总则与定义
GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第2 部分：确定标准测量方法重现性
与再现性的基本方法
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 20001.4 标准编写规则第4 部分：试验方法标准
GB/T 38576 人类血液样本采集与处理
JJF 1528 飞行时间质谱仪校准规范
WS/T 408 临床化学设备线性评价指南
WS/T 461 糖化血红蛋白检测
3 术语和定义
WS/T 408和WS/T 461界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
验证verification
通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定。
注: 本文件中的验证主要是指分析系统的验证，即分析系统在实验室的性能是否与规定性能指标或生产厂商提供的
性能指标一致。
[来源：WS/T 461-2015，定义3.2 ]
3.2
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糖化血红蛋白hemoglobin
A1C；HbA1C
血液中葡萄糖与血红蛋白1 个或2 个β链N 末端缬氨酸反应，发生不可逆糖基化所形成的稳定
化合，全称为：血红蛋白β链(血液)-N-(1-脱氧果糖-1-基)血红蛋白β链。
[来源：WS/T 461-2015，定义3.3，有修改]
3.3
线性linearity
在给定的测量范围内，使测定结果与分析物的量直接成比例的能力。
注：此处的测定结果指最终的分析结果，而非仪器输出的原始信号。
[来源：WS/T 408-2012，定义2.2，有修改]
3.4
线性范围linear range
使实验系统的最终分析结果为可接受的线性的浓度范围，此时非线性误差应低于允许误差。
[来源：WS/T 408-2012，定义2.3 ]
4 方法概述
新鲜或冷冻的人全血样品经稀释液稀释后，红细胞破裂并释放出其中的血红蛋白分子，按一定比例
与芥子酸（sinapic acid，SA)基质混和均匀后点在靶板上，干燥后加载到基质辅助激光解吸电离飞行时
间质谱仪（MALDI-TOF MS）中进行检测（激光波长349 nm）。采用外标法对样品中的糖化血红蛋白
HbA1C 含量进行定量。
5 试验条件
试验温度：20℃～25℃。
相对湿度:40%RH～60%RH。
6 试剂和材料
6.1 试剂
6.1.1 水：GB/T 6682 定义的实验室一级用水。
6.1.2 乙腈（ACN）：色谱纯。
6.1.3 芥子酸（SA）：纯度大于99.0%，适用于MALDI 基质。
6.1.4 三氟乙酸（TFA）：色谱纯。
6.1.5 糖化血红蛋白HbA1C 标准物质：量值可溯源的人全血基质血红蛋白A1C 标准物质。
6.2 溶液配制
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6.2.1 稀释液
在500 mL 试剂瓶中加入500 mL 水和500 μL TFA 后旋紧瓶盖，上下颠倒混匀3 次。
6.2.2 基质液
准确称取20 mg SA 于15 mL 离心管中，加入4 mL ACN 和6mL 稀释液（6.2.1），超声大约5 分
钟至固体粉末完全溶解，室温、避光可保存1 个月。
6.2.3 基质使用液
在15 mL 离心管中加入5 mL 稀释液（6.2.1）和5 mL 基质液（6.2.2）涡旋混匀30 秒。现用现配。
6.3 材料
6.3.1 离心管：0.6 mL、1.5 mL、15 mL 三种规格的聚丙烯离心管。
6.3.2 移液吸头：1 mL、200 μL、10 μL 三种规格的移液吸头，配套移液器使用。
6.3.3 试剂瓶：500 mL 的透明玻璃试剂瓶。
6.3.4 靶板：MALDI-TOF MS 使用的孔径为3.0 mm 的不锈钢靶板。
7 仪器和设备
7.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪
7.1.1 质量偏差要求
外标法，血红蛋白标准物质（m/z=15868），质量偏差容许≤500 ppm，测试靶板全范围质量准确度
≤500 ppm；仪器校准方法按JJF1528 的规定。
7.1.2 质量分辨率要求
血红蛋白标准物质（m/z=15868）测试质量分辨率应≥800。仪器校准方法按JJF 1528 的规定。
7.1.3 灵敏度要求
测试血红蛋白标准物质，m/z=15868 信噪比应>200。仪器校准方法按JJF 1528 的规定。
7.2 电子天平：感量0.0001 g。
7.3 涡旋式混合器：速度范围0-2500 rpm。
7.4 微量移液器：最大量程1000 μL、100 μL、10 μL 和2.5 μL 各一支。
7.5 电加热板（可选）：加热温度范围5℃~380℃，传感器控制精度±0.5℃。
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7.6 超声清洗仪：功率不低于250W，或相当的设备。
8 样品
8.1 一般要求
样品采集与处理应符合GB/T 38576 的要求。
8.2 样品采集
采用含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的采血管或毛细玻璃管，按照适用于临床实验室检测的常
规方法采集人全血样品，采集人全血样品不受饮食和采集时间的影响。
8.3 样品用量
样品量应不少于15 μL。
8.4 样品保存及冻融
新鲜人全血样品于2℃~8℃保存时间不超过5 天；冷冻人全血样品于-70℃及以下温度保存时间不
超过1 年。冷冻人全血样品使用前应在室温下融化、充分混匀。
9 试验步骤
9.1 样品处理
取1.5 mL 离心管，加入995 μL 稀释液（6.2.1），然后取5 μL 人全血样品加入离心管中，涡旋混
匀30 秒，然后从中移取5 μL 加入0.6 mL 离心管中，加入45 μL 基质使用液（6.2.3），涡旋混匀30 秒，
最后从中取2.5 μL 点在靶板的靶孔内，在室温下自然干燥或39℃加热干燥。每个样品重复2 次。
9.2 仪器参考采集条件
9.2.1 聚焦质量（Focus Mass）：m/z 15000。
9.2.2 采集质量范围：m/z 2000 ~ m/z 35000。
9.2.3 扫描速度：1 mm/sec。
9.2.4 检测器电压：-0.66 kV。
9.2.5 激光频率：2000 Hz。
9.2.6 激光能量：9.4 μJ。
9.2.7 激光波长：349 nm。
9.3 样品测试
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将载有样品的靶板置于MALDI-TOF MS中，按照8.2仪器条件对标准物质和样品进行检测。
9.4 标准曲线制备
9.4.1 标准溶液配制
将糖化血红蛋白HbA1C 含量≤3.45%和≥19.50%的两个糖化血红蛋白HbA1C 高、低值标准物质分别用
水稀释200 倍后，按照一定的比例混合得到5 个糖化血红蛋白HbA1C 含量介于3.45%~19.50%之间的梯
度浓度标准品，含量从低到高分别标记为L1、L2、L3、L4 和L5。
9.4.2 数据采集
分别移取45 μL 的基质使用液（6.2.3）于5 个0.6 mL 的离心管中，再分别移取L1~L5 梯度浓度标
准品各5 μL 依次加入上述5 个0.6 mL 的离心管中，涡旋混匀30 秒后，从每个离心管中移取2.5 μL 点
在靶板的相应靶孔内，在室温下自然干燥或39℃加热干燥后用MALDI-TOF MS 按照8.2 仪器条件进行
数据采集。
9.4.3 标准曲线制备
依据得到梯度浓度标准品质谱图数据（见附录A），提取人全血血红蛋白β珠蛋白峰面积和糖化β
珠蛋白峰面积。以N 末端缬氨酸糖基化修饰β珠蛋白（m/z=16030）的峰面积占总β珠蛋白峰面积
（m/z=16030 和m/z=15868）的百分比为横坐标，以糖化血红蛋白HbA1C 含量为纵坐标，拟合得到定量
标准曲线（线性拟合优度R2≥0.990）。
10 试验数据处理
10.1 结果计算
依据得到的样品质谱图数据，提取人全血血红蛋白β珠蛋白峰面积和糖化β珠蛋白峰面积，根据公式
（1）计算得到N 末端缬氨酸糖基化修饰β珠蛋白（m/z=16030）的峰面积占总β珠蛋白峰面积（m/z=16030
和m/z=15868）的百分比，带入8.4 标准曲线制备拟合得到的定量标准曲线，计算得到糖化血红蛋白HbA1C
含量。
注：在样品处理和样品测试过程中，样品中糖化血红蛋白HbA1C 含量实际没有变化，因此依据标准曲线计算得到的
结果即为样品中的糖化血红蛋白HbA1C 含量。
式中：
β珠蛋白糖化率—糖化β珠蛋白峰面积占总β珠蛋白峰面积的百分比，单位为%；
SGlc-βHb—糖化β珠蛋白峰面积，单位为Vamu；
SβHb—β珠蛋白峰面积，单位为Vamu。
10.2 结果表达
以NGSP 的传统单位（%）报告糖化血红蛋白HbA1C 含量测定结果，可同时报告IFCC 的国际单
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位制单位（mmol/mol）结果。结果保留小数点后2 位。
IFCC 单位（mmol/mol）与NGSP（%）单位之间换算可参见公式（2）：
式中：
IFCC—国际临床化学和检验医学联合会给糖化血红蛋白定义的单位(mmol/mol)；
NGSP—美国国家糖化血红蛋白标准化计划给糖化血红蛋白定义的单位（%）。
11 精密度和测量不确定度
11.1 精密度
本文件的精密度试验由5 个实验室对5 个水平的EDTA 全血样本糖化血红蛋白进行测定。在GB/T
6379.1 规定的重复性条件下，每个实验室对每个水平测定12 次。具体的重复性限r 和再现性限R 见表
1。
表1 糖化血红蛋白测定方法的精密度
HbA1C浓度范围/% 重复性限r/% 再现性限R/%
4.59～5.90 0.32 0.46
6.10 0.22 0.24
9.70～16.35 0.17 0.22
11.2 测量不确定度
根据GB/T 20001.4规定，使用者有需要时，可给出测量不确定度。但是，试验方法不适用也无义务
提供确切值以供使用者估算不确定度。测量不确定度应以使用试验方法所得的样品测试结果为基础进行
估算，并可与测试结果一起报告。建议以扩展不确定度的形式（测试结果±U的数字值）报告，需明确
包含因子k的取值，通常k=2。
12 质量保证和控制
建立标准曲线，需要用质控样品确认标准曲线的有效性。
在样品检测过程中，每次检测都应对标准品和质控样品进行检测，如质控样品测定值与参考值的偏
倚大于参考值的10%，应重新建立标准曲线。标准品或质控样品的含量以被测物附近的浓度为宜。
质控样品应与待测样品具有相似的特性，并且有已知的浓度或含量，建议糖化血红蛋白HbA1C含量
在6.00%~6.50%之间。
13 试验报告
试验报告应当包括下列（但不限于）内容：
识别样品、实验室和试验日期所需的全部资料；
本文件编号；
结果及其表示；试验报告推荐模板见附录B。
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附录A
（资料性）
糖化血红蛋白HbA1C标准物质的质谱图
A.1 糖化血红蛋白HbA1C标准物质的质谱见图A.1。
图A.1 糖化血红蛋白HbA1C 标准物质的质谱图（m/z 2000 ~ m/z 35000）
A.2 糖化血红蛋白HbA1C 标准物质的质谱见图A.2。
图A.2 糖化血红蛋白HbA1C 标准物质的质谱图（m/z 14800 ~ m/z 16800）
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附录B
（资料性）
试验报告推荐模板
糖化血红蛋白（HbA1C）检验结果报告单推荐模板见表B.1。
表B.1 糖化血红蛋白（HbA1C）检验结果报告单
标本条码检测单位送检标本
实验号标本情况采样时间
接收时间操作人联系电话
项目结果(NGSP) 单位结果（IFCC） 单位
糖化血红蛋白（HbA1C） % mmol/mol
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附录C
（资料性）
起草单位和主要起草人
本文件起草单位：融智生物科技（青岛）有限公司、北京大学深圳医院、首都医科大学附属北京
朝阳医院、南方医科大学珠江医院、中国科学院生物物理研究所、中国农业大学、烟台大学生命科学院、
北京融智优谱生物科技有限公司、杭州意诚默迪生物科技有限公司、上海伍丰科学仪器有限公司。
本文件主要起草人：纪玲、李晨、李岩、李运涛、林建涵、马雪婷、马昱、宋合兴、孙德慧、王
绪敏、王玉玺、温斌斌、吴轶、谢雯春、徐安平、张瑞、周宏伟、周晓光。
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源性.