GB/T 45238-2025 化学品 用虹鳟肝S9亚细胞组分测定体外固有清除率试验

中华人民共和国国家标准
ICS 13.300
CCS A 80
GB/T 45238—2025
化学品　用虹鳟肝S9 亚细胞组分测定
体外固有清除率试验
Chemicals—Determination of in vitro intrinsic clearance using rainbow trout
liver S9 sub⁃cellular fraction（ RT⁃S9）
2025⁃01⁃24 发布2025⁃05⁃01 实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
发 布

GB/T 45238—2025
目　　次
前言··························································································································Ⅲ
引言··························································································································Ⅳ
1　范围·······················································································································1
2　规范性引用文件········································································································1
3　术语和定义、符号和缩略语··························································································1
4　试验原理·················································································································3
5　受试物信息··············································································································3
6　参比物····················································································································4
7　试验准备·················································································································4
8　试验程序·················································································································5
9　数据处理·················································································································6
10　质量保证与质量控制· ······························································································7
11　结果报告···············································································································7
附录A（资料性）　虹鳟肝S9 亚细胞组分的制备···································································9
附录B（资料性）　虹鳟肝亚细胞组分的表征·······································································16
附录C（资料性）　酶促失活的虹鳟肝S9 亚细胞组分的制备···················································17
附录D（资料性）　初步试验反应条件的建立·······································································18
附录E（资料性）　试验方法的建立···················································································20
附录F（资料性）　缓冲溶液、辅因子、丙甲甘肽溶液的配制和RT⁃S9 的稀释· ·····························22
参考文献····················································································································25
Ⅰ

GB/T 45238—2025
前 言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC 251）提出并归口。
本文件起草单位：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、生态环境部固体废
物与化学品管理技术中心、中检科健（天津）检验检测有限责任公司、中国水产科学研究院珠江水产研
究所。
本文件主要起草人：梅承芳、许玫英、陈桂兰、王青柏、陈会明、窦从从、林健辉、曾国驱、周丽丽、
刘晓建、梁秋、柳燕贞、刘纯新、冯宝欣、谭文蔚、区丽娴、梁平缓、王英英。
Ⅲ
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引　　言
为提高化学品对鱼类生物蓄积作用的预测能力，需建立鱼体内肝脏生物转化的评估方法并将相关
信息纳入已建立的计算机模型。目前主要利用肝组织的体外代谢系统测定化学品的固有清除率。
本文件描述了基于虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）肝S9 亚细胞组分（RT⁃S9），采用底物清除法测定
受试物体外固有清除率（CLIN VITRO，INT）的试验方法。OECD 化学品测试导则No.319A 和OECD 化学
品测试指南文件No.280 描述了开展试验的详细步骤，以及如何将CLIN VITRO，INT 用于鱼类生物蓄积性的
计算机模型预测。
简而言之，根据确定的CLIN VITRO，INT 估算肝脏固有清除率，并采用基于生理学的毒代动力学
（PBTK）模型进一步评估鱼类的生物蓄积作用。也可采用合适的体外-体内外推模型（IVIVE）将该值
外推获得全身（体内）的生物转化速率常数。如果受试物处于模型的应用范围内，可将测得的
CLIN VITRO，INT 作为输入信息，应用于基于生物转化的生物富集计算机预测模型。
体内生物转化率可用于计算机模型预测生物富集系数（BCF）。将体外方法获得的生物转化数据
整合到鱼类一室模型中，可显著改善模型性能，与代谢缺失时得到的预测结果相比，整合生物转化数据
后的模型对生物富集结果的预测更接近试验值。
本文件的重复性已通过6 个实验室开展的比对试验（针对5 种受试物和1 种参比物）进行了验证。
已对部分化学品开展了基于鱼类肝细胞、肝S9 亚细胞组分或微粒体的相关测试，并获得了
CLIN VITRO，INT。欧盟委员会联合研究中心已开发鱼类体外生物转化数据库，涵盖了采用体外方法（肝细
胞、S9、微粒体）测定的固有清除率数据，这些均为本文件的适用性提供了参考。
如采用本文件对混合物、难测试物质（如不稳定物质）或适用范围内未指明的受试物开展测试，先
考虑试验结果是否具有科学意义。
Ⅳ
GB/T 45238—2025
化学品　用虹鳟肝S9 亚细胞组分测定
体外固有清除率试验
1　范围
本文件描述了用虹鳟肝S9 亚细胞组分测定化学品体外固有清除率的试验方法，包括试验原理、受
试物信息、参比物、试验准备、试验程序、数据处理、质量保证与质量控制和结果报告。
本文件适用于测定化学品的体外固有清除率，可准确定量的最低体外一级清除速率常数（Ke）约为
0.05 h-1~0.14 h-1。如有特殊需要，也可用于识别代谢产物。
2　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于
本文件。
GB/T 21801　化学品　快速生物降解性　呼吸计量法试验
GB/T 21802　化学品　快速生物降解性　改进的MITI 试验（Ⅰ）
GB/T 21803　化学品　快速生物降解性　DOC 消减试验
GB/T 21831　化学品　快速生物降解性：密闭瓶法试验
GB/T 21845　化学品　水溶解度试验
GB/T 21852　化学品　分配系数（正辛醇⁃水）　高效液相色谱法试验
GB/T 21853　化学品　分配系数（正辛醇⁃水）　摇瓶法试验
GB/T 21855　化学品　与pH 有关的水解作用试验
GB/T 21856　化学品　快速生物降解性　二氧化碳产生试验
GB/T 21857　化学品　快速生物降解性　改进的OECD 筛选试验
GB/T 22052　用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系及初始分解温度的方法
GB/T 22228　工业用化学品　固体及液体的蒸气压在10-1 Pa 至105 Pa 范围内的测定　静态法
GB/T 22229　工业用化学品　固体及液体的蒸气压在10-3 Pa 至1 Pa 范围内的测定　蒸气压平
衡法
GB/T 27850　化学品　快速生物降解性　通则
GB/T 42426　化学品　蒸气压试验
OECD 化学品测试导则No. 112　水中解离常数（Dissociation Constants in Water）
OECD 化学品测试导则No. 310　快速生物降解⁃密闭瓶二氧化碳法（顶空试验）［Ready Biode⁃
gradability—CO2 in Sealed Vessels（ Head Space）］
OECD 化学品测试导则No. 316　化学品在水中的光转化直接光解试验（Phototransformation of
Chemicals in Water—Direct Photolysis）
3　术语和定义、符号和缩略语
3.1　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
1
GB/T 45238—2025
3.1.1
生物富集系数　bioconcentration factor；BCF
试验吸收阶段的任何时间，试验生物体（或特定组织）内某种受试物浓度与试验介质中该物质浓度
的比率。
3.1.2
一级清除动力学　first⁃order depletion kinetics
底物分子清除的速率与其浓度成正比的化学反应。
3.1.3
性腺指数　gonadosomatic index；GSI
性腺质量与生物体质量的比例。
注： 虹鳟鱼的性成熟度可通过GSI 来判断，GSI 小于0.05 的雄性和GSI 小于0.5 的雌性通常被视为性未成熟。
3.1.4
S9 亚细胞组分　S9 sub⁃cellular fraction
来源于器官（通常是肝脏）表面的一部分组织，含有细胞质和微粒体酶的无细胞系统。
注： 在合适的介质中匀浆，通常在9 000 g 条件下离心20 min；如果从鱼中提取，离心速度为13 000 g。
3.1.5
体外固有清除率　in vitro intrinsic clearance；CLIN VITRO，INT
在体外条件下，单位时间内单位酶或细胞对受试物代谢的速率。
注： 反映体外代谢模型（如S9、肝微粒体和肝细胞）中受试物的代谢清除率。
3.1.6
清除速率常数　elimination rate constant；ke
单位时间内受试物从体内的清除量与体内总量的比值。
3.1.7
辅因子　cofactor
在生物体系中可与主要组分结合并具有辅助功能的分子或离子。
注： 如酶的辅因子、转录和信号转导过程中的辅因子等。
3.1.8
运行　run
使用独立配制的溶液和RT⁃S9 实施的一次完整试验。
3.2　符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。
CYP：细胞色素P450（Cytochrome P450）
DTT：DL⁃二硫苏糖醇（DL⁃Dithiothreitol，CAS No.：3483⁃12⁃3）
EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic Acid，CAS No.：60⁃00⁃4）
EROD：乙氧基异吩唑⁃O⁃脱乙基酶（Ethoxyresorufin⁃O⁃Deethylase）
GC：气相色谱（Gas Chromatography）
GSH：还原型谷胱甘肽（L⁃Glutathione）
GST：谷胱甘肽转移酶（Glutathione Transferase）
HBSS：Hanks 平衡盐溶液（Hanks’ Balanced Salt Solution）
HEPES：2⁃[4⁃（2⁃羟乙基）⁃1⁃哌嗪基]⁃乙磺酸[4⁃（2⁃Hydroxyethyl）⁃1⁃Piperazineethanesulfonic Acid，
CAS No.：7365⁃45⁃9]
HPLC：高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography）
IVIVE model：体外⁃体内外推模型（In Vitro to In Vivo Extrapolation Model）
2
GB/T 45238—2025
KM：米氏常数
LOQ：定量限（Limit of Quantification）
MS⁃222：3⁃氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（Tricaine Methanesulfonate，CAS No.：886⁃86⁃2）
NADPH：β⁃烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2 ′⁃磷酸，还原型四钠盐（Nicotinamide Adenine Dinucleotide 2'⁃
Phosphate，CAS No.：2646⁃71⁃1）
PAPS：腺苷 3 ′⁃ 磷酸盐 5 ′⁃ 磷酸硫酸盐（Adenosine 3' ⁃ Phosphate 5' ⁃ Phosphosulfate，CAS No.：
109434⁃21⁃1）
pKa：酸解离常数
RT⁃S9：虹鳟鱼肝S9 亚细胞组分（Rainbow Trout Liver S9 Subcellular Fraction）
SULT：磺基转移酶（Sulfotransferase）
UDPGA：尿苷 5 ′⁃二磷酸葡萄糖醛酸　三钠盐（Uridine 5'⁃Diphosphoglucuronic Acid，CAS No.：
63700⁃19⁃6）
UGT：尿苷5 ′⁃二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（Uridine 5'⁃Diphospho⁃Glucuronosyl Transferase）
UVCBs：未知或可变成分、复杂反应产物或生物材料（Unknown or Variable Composition，Complex
Reaction Products or of Biological Materials）
Vmax：受试物浓度达到饱和条件下的最大酶促速率（Maximum Enzymatic Rate at Saturating Test
Chemical Concentration）
4　试验原理
利用虹鳟肝S9 亚细胞组分所含Ⅰ相酶（如CYP）和Ⅱ相酶（如SULT、UGT、GST）的生物转化能
力，通过底物清除法获得受试物的CLIN VITRO，INT。配制由虹鳟肝S9 亚细胞组分、磷酸钾缓冲溶液、酶辅
因子和丙甲甘肽组成的体系，通过添加受试物以启动反应，在反应的不同时间点采样，并转移至终止溶
液中以终止反应。采用经验证过的分析方法测定不同时间采样样品中受试物的浓度，以获得受试物浓
度随孵育时间下降的曲线图，并计算CLIN VITRO，INT。试验过程使用酶促失活的RT⁃S9 作为阴性对照，以
区分酶促生物转化和非生物下降。
5　受试物信息
受试物信息包括：
a） 按照GB/T 21845 方法测定的水中溶解度；
b） 在有机溶剂中的溶解度（如需制备受试物贮备液）；
c） 按照GB/T 21852 或GB/T 21853 方法测定的正辛醇⁃水分配系数或关于分配行为的其他信息；
d） 按照GB/T 21855 方法测定的水解作用或按照OECD 化学品测试导则No.316 测定的光稳
定性或在试验用水/试验介质中的稳定性；
e） 按照GB/T 22052、GB/T 22228、GB/T 22229、GB/T 42426 方法测定的蒸气压；
f） 关于生物或非生物降解性的信息，如按照GB/T 21801、GB/T 21802、GB/T 21803、GB/T 21831、
GB/T 21856、GB/T 21857、GB/T 27850 或OECD 化学品测试导则No.310 测定的快速生物
降解性试验结果；
g） 酸解离常数，用于可离子化的受试物（pH 的微小变化可改变这类物质在解离和未解离之间的
平衡），如按照OECD 化学品测试导则No.112 测定的水中解离常数；
h） 应具备已知准确度、精密度和灵敏度的分析方法，明确孵育体系中受试物的定量限，并提供详
细的样品前处理和储存方法。
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GB/T 45238—2025
6　参比物
采用参比物如芘作为阳性对照建立相关试验系统并检验其有效性。
7　试验准备
7.1　仪器设备
除常规实验室仪器设备外，还需要以下设备：
a） 冷藏冰箱（4 ℃）、冰箱（-20 ℃）和超低温冰箱（-80 ℃）；
b） 分析天平；
c） pH 计；
d） 旋涡混合器；
e） 微量冷冻离心机；
f） 样品孵育设备，如可加热和制冷的水浴振荡器、振荡培养箱，或可振荡的恒温混匀仪；
g） 孵育玻璃瓶（如7 mL 闪烁管）；
h） 微量离心管（如1.5 mL）；
i） 玻璃器皿和样品瓶；
j） 移液器和吸头。
7.2　配制试剂用的辅因子和试剂
主要辅因子和化学试剂包括：
a） 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2'⁃磷酸四钠盐（NADPH）；
b） 尿苷5 ′⁃二磷酸葡萄糖醛酸三钠盐（UDPGA）；
c） 还原型谷胱甘肽（GSH）；
d） 腺苷3 ′⁃磷酸5 ′⁃磷酸硫酸锂盐化合物（PAPS）；
e） 丙甲甘肽；
f） 磷酸氢二钾（K2HPO4）；
g） 磷酸二氢钾（KH2PO4）。
注： 以上试剂为分析纯或同等级别，但PAPS 的纯度（质量分数）可能小于95%。
7.3　分析测定用的试剂
所用试剂应满足以下要求：
a） 能溶解受试物的溶剂（如甲醇、乙腈和丙酮）应为分析纯或同等级别，所用溶剂应与磷酸钾反
应体系中使用的水溶介质相混溶；
b） 终止和萃取溶剂（如甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚）。
7.4　RT⁃S9
7.4.1　RT⁃S9 可来自商售，或按照示例进行制备（见附录A）。
7.4.2　应测定每批次RT⁃S9 的蛋白浓度（见附录A），同时评估每批次RT⁃S9Ⅰ相和Ⅱ相酶的生物转
化能力，酶活力的测定方法见附录B。在试验开始时或RT⁃S9 首次使用前，应利用酶活力特征分析或
者已知参比物来检验新批次RT⁃S9 的有效活性。保存期间，应随时监测RT⁃S9 的活性。
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GB/T 45238—2025
7.4.3　试验应包含酶促失活（如加热失活）的阴性对照组，通过阴性对照区分酶活性转化和非生物性下
降（缘于孵育瓶吸附、挥发以及非生物降解）。酶加热失活的操作方法见附录C。
8　试验程序
8.1　试验条件
8.1.1　开展预试验，确定底物浓度、蛋白浓度和孵育时间等参数，建立的孵育条件应满足准确测定肝固
有体外清除率和建立一级清除动力学的要求（见附录D）。
8.1.2　足量的采样点有助于构建高质量的浓度对数转换回归方程，至少设置6 个采样点。
8.1.3　RT⁃S9 的酶活性易逐步丧失，其孵育总时长不应超过2 h；对于生物转化作用非常缓慢的受试
物，可适当延长孵育时间（最高可达4 h）；对代谢率较低的受试物进行测试具有一定局限性。
8.1.4　包括7 个时间点的单瓶法测定示例见附录E 的图E.1，该方法适用于易分析的受试物（如无挥
发性、不吸附在容器壁上、在培养系统中可迅速分布），其结果变异性较小，且操作简单。对于具有挥发
性、疏水性强的受试物，宜采用多瓶法，多瓶法的测定示例见附录E 的图E.2。
8.1.5　每个试验应至少包括2 次完整的试验运行以确定CLIN VITRO，INT，2 次运行均应满足以下条件：
a） 分别单独配制新的贮备液和试验溶液；
b） 分别使用单独解冻的RT⁃S9，RT⁃S9 可源于同一批次。
8.1.6　如果2 次运行中活性RT⁃S9 的回归分析具有显著性差异（如对斜率开展t 检验，p 小于0.05），
则应进行第3 次运行，以获得2 次有效结果。若3 次运行获得的结果均有显著性差异，则应调整参数
重新开展预实验。
8.2　受试物、缓冲液、辅因子与终止溶液的配制
8.2.1　以下内容（8.2~8.5）主要以单瓶法举例描述，多瓶法的描述见附录E。
8.2.2　用磷酸钾缓冲溶液（见附录F 的表F.2）或提前验证过的溶剂配制受试物贮备液，常见溶剂如丙
酮、乙腈和甲醇。若贮备液并非新鲜配制，应在试验前评估受试物贮备液的稳定性。
8.2.3　对于挥发性受试物，可使用密闭培养瓶（如带隔垫的GC 瓶）。对于溶解性非常低的受试物可使
用玻璃内插管或受试物被动添加的方式。
8.2.4　根据预试验结果，在试验当天用磷酸钾缓冲溶液（见附录F 的表F.2）或有机溶剂稀释受试物贮
备液，制备所需浓度的试验溶液。如使用有机溶剂，其在混合孵育体系中的含量应尽可能低，体积比不
应超过1%，以免抑制酶活性。丙甲甘肽溶液（见附录F）中已含有一定量有机溶剂，可在一定程度上影
响反应体系中有机溶剂的终浓度（如0.25%）。受试物的试验浓度通常高于分析方法LOQ 的10 倍，
能产生预试验中确定的一级动力学即可。
8.2.5　缓冲溶液、辅因子和丙甲甘肽溶液的配制见附录F。贮备液可提前配制，如试验开始前1 d，但
稀释溶液应在试验当天配制。
8.2.6　配制如甲醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁醚等终止溶液，其可包含内标。通常预先加入一定体积
的终止溶液（如100 μL 样品对应400 μL 终止溶液）至1.5 mL 微量离心管中，并置于冰上。如果使用
挥发性溶剂（如二氯甲烷、甲基叔丁醚），应将管盖盖紧并冷藏，或在采样时间点之前直接添加溶剂。如
果溶剂与塑料具有相互作用，应采用玻璃管。
8.3　RT⁃S9 与混合孵育体系的准备
8.3.1　解冻一定体积的活性RT⁃S9 和酶促失活的RT⁃S9，用磷酸钾缓冲溶液（见附录F 的表F.2）稀
释。如果混合孵育体系中蛋白终浓度为1 mg/mL，可预先稀释至10 倍蛋白浓度（如10 mg/mL），计算
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和稀释方法见附录F。活性RT⁃S9 应在冰水浴中解冻。宜额外增加25%~30% 体积的活性/酶促失
活的RT⁃S9，以提供适度过量的生物材料。例如，如果活性和非活性RT⁃S9 各需300 μL RT⁃S9 稀释
液，可分别准备400 μL。
8.3.2　如附录E 的图E.1 所示的单瓶法中，使用2 个装有活性RT⁃S9 的小瓶和1 个装有酶促失活RT⁃S9
的小瓶，同时考虑设置的取样时间点数。过量的活性RT⁃S9 不应重新冷冻后使用，但可用于制备非活
性RT⁃S9，过量的非活性RT⁃S9 可复冻备用。
8.3.3　加入400 μL 磷酸钾缓冲溶液（pH 7.8，见附录F 的表F.2）到3 个孵育瓶中，再将活性或酶促失
活的RT⁃S9 稀释液各100 μL 加入相应瓶中，加入100 μL 丙甲甘肽工作溶液（250 μg/mL）到每个孵育
瓶中，并将孵育瓶置于冰上预孵育15 min。
8.3.4　如附录F 所述配制辅因子混合液，主要包含NADPH、UDPGA、GSH 和PAPS，将其充分混合
并置于冰上，尽可能缩短放置时间。将400 μL 辅因子混合液加入到每个预培养瓶中（置于冰上），将每
个小瓶轻轻旋转直至充分混合，混合液成分见附录F 的图F.1。因PAPS 易快速降解，其应在加入丙
甲甘肽后的预孵育期间配制，并与其他辅因子充分混合后加入孵育体系。
8.3.5　将孵育瓶置于振荡水浴箱或培养箱中，在11 ℃±1 ℃下预孵育10 min，同时轻微摇动。由于生
物转化速率对温度敏感，应使用水浴振荡器、培养箱、热混合器等设备严格控制试验温度。
8.4　启动反应与终止反应
8.4.1　根据受试物贮备液的浓度取一定体积的受试物溶液，直接加入到每瓶孵育混合体系（通常为1 mL）
中启动反应，将孵育瓶旋转使受试物均匀分散并松散地盖上盖子。
8.4.2　在指定时间点采样，将孵育瓶从水浴或培养箱中取出，轻轻旋转或摇动，用移液器取出等分试样
（如100 μL）并直接转移至相应的含有预冷终止液的1.5 mL 微型离心管中（置于冰上）。将移液器在终
止液中上下吸取3 次，以确保样品的全部转移。
8.4.3　将微量离心管置于冰上，直至收集完所有时间点的样品。若使用与水混溶的溶剂作为终止溶
液，离心前将样品冷藏过夜将有助于促进蛋白质的完全沉淀。如果使用挥发性溶剂（如二氯甲烷和甲
基叔丁醚），样品应经过提取，宜在终止反应后立即提取。应通过预试验来确定终止反应后蛋白质是否
完全沉淀。
8.4.4　采样完成后（针对挥发性溶剂，应在每次采样后），对微量离心管进行混匀（如1 500 r/min~
2 000 r/min，涡旋3 min）和离心（如20 000 g，4 ℃条件下离心5 min）。如果预试验表明受试物回收率
较低，可延长涡旋时间（如10 min）。某些受试物需冷藏过夜，以确保最大限度地提取。将上清液转移
至如HPLC/GC 样品瓶中，在-20 ℃±1 ℃条件下保存，直至分析。
8.5　样品采集与浓度分析
8.5.1　在每次运行中，1 瓶活性RT⁃S9 和1 瓶酶促失活的RT⁃S9 需添加受试物，另1 瓶活性RT⁃S9
添加参比物，在不同的时间点采样，如2 min、10 min、20 min、30 min、60 min、90 min 和120 min（见附录
E）。有时需要增加试验瓶数量（如每瓶设置平行）以保证精确分析受试物浓度。对于酶促失活的对照
组，可根据预试验结果减少采样次数。
8.5.2　使用经验证过的分析方法测定样品中受试物的浓度。试验质量主要取决于化学分析的准确度、
精密度和灵敏度，因此应提前验证受试物分析方法的准确度、精密度和重现性，及受试物在混合孵育体
系中的回收率（80%~120%）。
9　数据处理
9.1　以经log10 转换的受试物浓度对时间作图，应呈现对数线性下降（R2 不小于0.85）。
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9.2　如果曲线图上出现明显的离群值，可使用统计上有效的离群检验去除虚假数据点，并记录去除理
由。如果在试验开始或结束时观察到非线性现象，可能与受试物降解或酶活性丧失/抑制有关，应在曲
线的线性范围内确定清除速率（至少包括6 个数据点）。
9.3　如果在失活RT⁃S9 的阴性对照中观察到受试物发生非生物损失，即使优化试验条件该损失仍无
法避免（即非生物下降大于20%），可从活性RT⁃S9 试验组测得的消耗速率中扣除该损失速率，以得到
经校正的体外固有清除率，但此时应证实非生物损失过程遵循一级动力学。
9.4　按照公式（1）计算体外固有清除率。
CLIN VITRO, INT =
Ke
CRT⁃S9
…………………………（ 1 ）
式中：
CL IN VITRO，INT ——体外固有清除率，单位为毫升每小时毫克蛋白（mL/h/mg prot）或毫升每小时10６
细胞（mL/h/106 cell），其中prot 指蛋白，cell 指细胞；
Ke ——一级清除速率常数，为-2.3 乘以对数⁃线性曲线的斜率，单位为1/小时（1/h）；
CRT⁃S9 ——培养体系中RT⁃S9 蛋白浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。
10　质量保证与质量控制
如满足以下条件，试验结果有效。
a） 应评估每批次RT⁃S9 催化Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶的反应能力（见附录B）。
b） 应确定每批次RT⁃S9 的蛋白浓度（见附录A），并应在预试验中提前确定测试底物（受试物）
和蛋白浓度，以符合一级动力学要求。混合孵育体系的蛋白浓度范围宜为0.25 mg/mL~
2 mg/mL，常用浓度为1 mg/mL。
c） 在培养期间，阴性对照（酶促失活RT⁃S9）组中受试物无显著损失（如小于活性RT⁃S9 试验组
中测定清除量的20%），且受试物浓度无明显增加（如大于20%）。
d） 至少通过6 个时间点确定CLIN VITRO，INT，计算回归方程和斜率，R2 应不小于0.85。对于代谢较
慢的受试物（如斜率较小），R2 可能小于0.85，此时应充分考虑在进行试验与不进行试验的情
况下，所得斜率与0 是否存在显著性差异。
e） 应至少进行2 次独立的运行，如果RT⁃S9 活性组的2 次回归统计结果具有显著性差异（如斜
率t 检验的p 小于0.05），则应进行第３次运行以获得2 次可靠的结果。
11　结果报告
试验报告应包括以下内容。
a） 受试物：
1） 单组分物质：物理性状、水溶解性及相关的物理化学性质；化学标识，如国际纯粹与应用
化学联合会（IUPAC）名称或CAS 名称、CAS 号、简化分子线性输入规范（SMILES）码
或国际化合物标识（InChI）码、结构式、纯度等信息，在适当情况下还应提供杂质的化学
鉴别信息。
2） 多组分物质、不明复杂物质（UVCBs）（组分未知或者可变的物质、复杂反应产物或者生
物材料）和混合物：尽可能提供各组分的化学鉴别信息（如上）、含量和相关的物理⁃化学
特性。
3） 受试物的定量分析方法。
b） RT⁃S9：
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GB/T 45238—2025
1） 如源于购买，应提供以下内容：商业来源、虹鳟鱼供应商、虹鳟鱼种系、驯养环境温度、虹
鳟鱼体重、肝脏质量和性腺指数（用以确定性成熟程度）；
2） 如源于制备，见附录A 的表A.1；
3） 特征描述（见附录B）。
c） 试验条件：
1） 受试物和参比物的浓度；
2） 受试物和参比物溶液配制方法；
3） 试剂的配制及组成；
4） 混合孵育体系的配制及组成；
5） 孵育温度；
6） 混合孵育体系的蛋白含量；
7） 试验方法：孵育方法（单瓶或多瓶）；
8） 平行数量（如果每次运行多于1 个平行）；
9） 独立运行的次数；
10） 采样时间点；
11） 预试验的描述。
d） 分析方法：完整描述所使用的受试物浓度分析方法，及其检出限、定量限、变异系数、回收率，
标准溶液和内标的配制方法等。
e） 统计方法：用于排除异常采样点和/或运行的统计方法。
f） 结果：
1） 预试验结果；
2） 单瓶法数据，每个运行（包括各浓度试验组、阳性对照组、阴性对照组）的采样时间；
3） 代谢产物和代谢途径的鉴别（如有）；
4） 根据具体情况计算受试物和参比物在每个运行中活性和非活性RT⁃S9 的CLIN VITRO，INT；
5） 无显著性差异的各运行的CLIN VITRO，INT 平均值和标准偏差，以及t 检验结果；
6） 被排除的采样点或运行；
7） 试验中的异常情况，对本文件的所有偏离及相关信息。
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GB/T 45238—2025
附　录　A
（资料性）
虹鳟肝S9 亚细胞组分的制备
A.1　虹鳟鱼的相关要求
试验用虹鳟鱼应符合下列相关要求。
a） 从性腺发育未成熟的虹鳟鱼中获取RT⁃S9。已有研究表明，性发育未成熟的虹鳟鱼的代谢能
力与其性别无关，因此收集RT⁃S9 时无需考虑鱼的性别。
b） 如鱼源于购买，使用前在实验室至少驯养两周。鱼在驯养期内不接受疾病治疗，如有可能，需
完全避免由供应商进行任何疾病治疗。不采用已有临床症状的鱼。
c） 虹鳟鱼的养殖温度宜在10 ℃~15 ℃范围内，接近该温度进行实验室驯养并维持在±2 ℃变化
范围内。采取较低的饲养密度，以确保最佳的生长条件和动物福利。
d） 定期测定水质参数并进行记录，包括：pH 值、总碱度（mg/L CaCO3）、溶解氧（mg/L，转换为饱
和度百分比）和总氨氮（mg/L）（见表A.1）。
e） 记录鱼的驯养条件，包括：光周期、饲养方式、饲料类型、水温、驯养密度（如kg 鱼/L）和每缸鱼
数量（尾/缸）（见表A.1）。报告上述具体信息，便于后续应用（如生物富集系数预测模型）中
使用特定参数。
注： 在冷冻状态（-80 ℃）下，组分样本可运送至不同地点，保存至少两年。
表A.1　鱼类信息、驯养条件和试验观察记录
鱼类信息
鱼的来源（如养殖场名称）
驯养条件
水源（如井水）
pH
鱼密度/（kg/L）
饲料类型
试验观察
鱼编号
1
2
3
4
鱼体重/g

性别（雌或雄）（如有）

肝脏质量/g

品系（如适用）
水的流速/（L/min）
溶解氧/（mg/L）
鱼尾数/（条/缸）
饲喂量（如鱼体重的%）
性腺质量/g

GSI（性腺质量×100/
鱼体重）

A.2　制备过程
新鲜肝脏组织制备S9 的主要步骤如下：
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a） 宜使用新鲜肝脏组织制备S9，冷冻和解冻鱼的肝脏组织会降低CYP 酶活性；
b） 宜从多条（3 条~6 条）鱼中收集RT⁃S9，有利于减少单尾鱼的影响，更好地代表一个种群；
c） 人道处死鱼后，用不含Ca2+/Mg2+的清洗缓冲液（见表A.2）经肝门静脉插管灌注，清除肝脏
血液；
d） 切除鱼肝脏，用匀浆缓冲液（见表A.2）进行匀浆后，在4 ℃下离心（13 000 g~15 000 g）20 min；
e） 将离心后的上清液等量分装至微量离心管或冷冻管中，并置于-80 ℃±1 ℃中保存。
表A.2　清洗缓冲液和匀浆缓冲液所需的试剂及浓度
溶液
清洗缓冲液
pH 7.8 贮存于4 ℃
匀浆缓冲液a
pH 7.8 贮存于4 ℃
a　可在匀浆缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。
试剂
1×HBSS（ 不含Ca2+/Mg2+）
0.5 mol/L EDTA
1 mol/L HEPES
50 mmol/L pH 7.8 Tris⁃HCl
1 mol/L KCl
0.5 mol/L EDTA
100 mmol/L DTT
蔗糖
每1 000 mL 添加的试剂体积或质量
985.4 mL
4.6 mL
10 mL
800 mL
150 mL
4 mL
10 mL
85.55 g
终浓度
mmol/L
—
2.3
10
50
150
2 L
1
250
A.3　设备和材料
A.3.1　仪器
主要仪器包括：
a） 用于麻醉鱼的容器；
b） 电子天平（1 g~2 000 g）；
c） 镊子、手术剪刀、单刃刀片；
d） 冷冻离心机；
e） 锥形离心管（如50 mL）；
f） 23⁃G×3/4 安全翼式输液器（蝴蝶导管）；
g） 一次性塑料注射器（30 mL）；
h） 蠕动泵；
i） 泵管；
j） 预冷后的玻璃培养皿；
k） 玻璃烧杯；
l） 具备特氟龙研磨棒的组织研磨器（30 mL）；
m） 多速台式钻床；
n） 吸管；
o） 吸管帽；
p） 血清移液管辅助器；
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q） 血清移液管；
r） 低温储存管（如1.8 mL）；
s） 微量离心管。
A.3.2　化学试剂
主要化学试剂包括：
a） 3⁃氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐（MS⁃222）；
b） 碳酸氢钠（NaHCO3）；
c） 无Ca2+、Mg2+ Hanks 平衡盐溶液；
d） 4⁃（2⁃羟乙基）1⁃哌嗪乙烷磺酸（HEPES）；
e） 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris⁃HCl）缓冲液，pH 7.8；
f） 1 mol/L 氯化钾（KCl）；
g） 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA⁃Na2）缓冲液；
h） 100 mmol/L 二硫代苏糖醇（DTT）；
i） 蛋白酶抑制剂混合物（可选）；
j） 蔗糖；
k） 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH）；
l） 1 mol/L 氢氧化钾（KOH）；
m） RT⁃S9 蛋白含量测定试剂盒。
A.4　化学试剂和溶液的配制
A.4.1　麻醉剂的配制
配制MS⁃222 溶液（CAS No.：886⁃86⁃2，150 mg/L）所用的水与驯养鱼的水一致。如配制8 L，向
水中加入1.2 g MS⁃222，搅拌至溶解。使用预先确定用量的NaHCO3 维持水的pH 值，针对低碱度的
水，NaHCO3 的用量大约是MS⁃222 的3 倍。
A.4.2　缓冲液的配制
A.4.2.1　按照表A.2 配制清洗缓冲液和匀浆缓冲液，配制量大约满足15 条鱼的灌注。
A.4.2.2　配制清洗缓冲液时，将EDTA（终浓度2.3 mmol/L）和HEPES（终浓度10 mmol/L）加入到
HBSS 平衡盐溶液（含4.2 mmol/L，即0.35 g/L NaHCO3，不含Ca2+和Mg2+）中。例如配制1 L 清洗缓
冲溶液，将4.6 mL 0.5 mol/L EDTA 和10 mL 1 mol/L HEPES 加入到985.4 mL HBSS 中，用1 mol/L
NaOH 将清洗缓冲液pH 调节至7.8，并于4 ℃下贮存。当月配制缓冲液，如发现明显污染（如出现漂浮
颗粒或浑浊）时予以弃除。
A.4.2.3　配制匀浆缓冲液时，将50 mL 1 mol/L Tris⁃HCl 与950 mL 超纯水混合。例如取800 mL
50 mmol/L Tris⁃HCl 与150 mL 1 mol/L KCl、4 mL 0.5 mol/L EDTA、10 mL 100 mmol/L DTT 和
85.55 g 蔗糖于1 L 容量瓶中混合，用1 mol/L KOH 溶液调节pH 至7.8，用50 mmol/L Tris⁃HCl 溶液
定容至刻度，于4 ℃下贮存。当月配制缓冲液，如发现明显污染（如漂浮颗粒或浑浊）时予以丢弃。如
果使用了蛋白酶抑制剂，则在最后一步添加。
A.5　虹鳟鱼的准备和解剖
虹鳟鱼的准备和解剖步骤如下：
a） 在处死鱼之前对鱼进行24 h 禁食；
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b） 由于RT⁃S9 蛋白在室温下会快速变性，尽量使用预冷的缓冲液、仪器和玻璃器皿进行相关
操作；
c） 将鱼捕获后置于一个装有8 L 麻醉剂（MS⁃222）的水缸或水桶中，鱼完全浸没在麻醉剂中至
少1 min，当鱼鳃盖停止运动，并完全失去平衡和肌肉张力，且对刺激无反应（通过用力挤压鱼
尾底部来判断）时，表明鱼已完全麻醉，随后对鱼的头部进行猛烈打击，以人道主义的方式将
鱼处死；
d） 称量并记录鱼的体重；
e） 鱼腹部朝上，采用以下方式进行解剖（见图A.1）；
注： 图中鱼已达到性成熟，仅用于展示说明。
图A.1　鱼安乐死后通过切口暴露的内部器官图
f） 用解剖刀从鱼的肛门到咽颊部开一个中间切口，注意不将解剖刀插入太深；
g） 从中间切口的末端近鱼尾处延伸至背部表面一半位置处横切一个小口；
h） 同样从中间切口末端近鳃盖处开一个类似的横切小口；
i） 切除翻开的皮瓣组织，暴露体腔，肝脏呈暗红色，找到肝门静脉的腹侧分支（从肠到肝门），小
心清除遮挡的结缔组织（见图A.2）；
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图A.2　输液器插入鱼肝门静脉清除肝脏血液的展示图
j） 在安全翼式输液器（23⁃G×3/4⁃in）插入肝门静脉之前，可选择先在静脉下方用丝质缝合线（4/0）
松散地进行缠绕，输液器连接一个30 mL 注射器，里面装有预冷的清洗缓冲液（见表A.1），插
入后用4/0 缝合丝线紧紧地缠绕固定住注射器的针头，以防止清洗缓冲液从插入部位泄漏，
切断从肝脏通往心脏的肝静脉，以便进行组织引流。
A.6　肝脏灌注
按照以下试验步骤，对虹鳟鱼肝脏进行灌注。
a） 用20 mL~30 mL 预冷的清洗缓冲液对肝脏进行灌注（约10 mL/min~15 mL/min），直至肝
脏的颜色变为白色（清除肝脏中的血液，如图A.3 所示）。灌注时对肝脏进行轻轻地按压有助
于血液流动，尤其是血流集中的部位。清除血液是为了确保RT⁃S9 中不含血源代谢酶，如血
浆蛋白酶。
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注： 图中鱼已达到性成熟，仅用于展示说明。
图A.3　成功清除血液后变白的肝脏外观图
b） 清除血液之后，将肝脏切除放置在冰冷的培养皿中，注意不要切破胆囊（一个薄壁囊，通常包
含暗绿色或棕色胆汁）。用剪刀剪断胆囊和肝脏的连接部分，小心移除胆囊。手持一个30 mL
注射器用5 mL~10 mL 预冷的清洗缓冲液对肝脏进行冲洗，由于胆囊汁会污染肝脏RT⁃S9
且使其代谢酶失活或变性，故通过冲洗以免肝脏与少量胆汁产生接触。一旦肝脏接触了大量
胆汁，停止后续处理。
c） 用纸巾将肝脏表面多余液体去除之后，对肝脏称重，精确至0.01 g。记录下肝脏的质量（见
表A.2）。将肝脏置于一个250 mL 烧杯中，里面装有150 mL 预冷的匀浆缓冲液，保持低温环
境直至同一批次的鱼全部完成肝脏收集。
d） 性腺（睾丸或卵巢）表现为沿着肾腹侧腹膜腔纵向延伸的两种组织。将性腺（卵巢或睾丸）整
体取出并称重，精确到0.01 g，记录下性腺质量，性腺质量与动物体重比值的100 倍即为性腺
指数（GSI），通过GSI 判断虹鳟鱼的性成熟度。
e） 通常认为雄鱼GSI 小于0.05、雌鱼GSI 小于0.5 代表了性未成熟，也可通过组织学判断鱼的
性成熟情况。
f） 上述操作需快速进行，从捕鱼开始至将肝脏置于匀浆缓冲液中单尾鱼操作总时长不超过15 min。
A.7　RT⁃S9 的制备
按照以下试验步骤，制备RT⁃S9。
a） 对肝脏进行取样和称重后，用剪刀或单边刀片将肝脏切成小片（小于0.5 cm2）。
b） 将切碎的肝脏组织连同匀浆液一起转移至组织研磨器（预冷并保持在冰上）内，用额外等量
（与肝脏质量相同）的匀浆缓冲液冲洗烧杯，将冲洗液全部倒入研磨器中。使用特氟龙研磨棒
（推荐间隙为0.1 mm~0.15 mm）将组织匀浆，该研杵连接在低速（如500 r/min）的台式钻床
上。操作时使研杵缓慢到达研磨器底部（每次冲程10 s~15 s），重复4 次~5 次。除上述外无
需采用其他额外的均质方式，因其可能导致蛋白质变性。
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GB/T 45238—2025
c） 将肝脏匀浆灌入一个50 mL 圆底离心管（预冷并置于冰上）中。假定鱼体重范围为400 g~
600 g，鱼的取样数量为4 条~5 条，则原始肝脏匀浆的预期体积约为50 mL~70 mL。
d） 肝脏匀浆在13 000 g，4 ℃下，离心20 min。将离心管轻轻地从离心机中取出。上清液表面可
能形成一层黄色脂质层（与所采集肝脏的脂肪含量有关），用吸管将黄色脂质层吸出并弃除。
将剩余的上清液（即混合的RT⁃S9）倒入或用血清吸管吸出转入150 mL 预冷的烧杯中，转移
时注意不要倒出底部的肝脏组织。离心管底部的沉淀颗粒组织相对较硬且呈棕色，其表面可
能形成一层浅色物质。
e） 合并的RT⁃S9 用玻棒或者其他类似器具进行混匀，将等份（如0.5 mL）的溶液转移至已标记
的1.8 mL 预冷储存管或微型离心管中，用液氮快速冷冻或将其贮存在其他同等环境中，全过
程将RT⁃S9 一直放置于冰上。推荐体重的4 条~5 条虹鳟鱼将会产生35 mL~45 mL RT⁃
S9，假设将其全部分成0.5 mL 等份储存，需要70 个~90 个预先标记好的储存管。储存管在
加入样品前提前置于-20 ℃冰箱中进行预冷，使用前预冷不超过24 h。
f） 收集含有RT⁃S9 的储存管，转移至液氮或-80 ℃±1 ℃冰箱中，可贮存至少2 年。
g） 记录一次采集制备中获得的RT⁃S9 总体积，用于计算每克肝脏组织中RT⁃S9 蛋白浓度。
A.8　RT⁃S9 蛋白含量的测定
取3 只RT⁃S9 样品管放入冰水浴中解冻（如将微型离心管支架置于盛有冰水的烧杯中），并在冰
晶融化后放置于冰上。测定同源均一的RT⁃S9 样品中蛋白含量，可使用标准测定方法如考马斯亮蓝
法（Bradford assay）或商售的蛋白含量测定试剂盒。遵照相关说明书进行操作，如采用96 孔平底板和
微孔板读取器、生物分析仪、比色皿和分光光度计或其他可准确地测定蛋白浓度的仪器和方法。对RT⁃S9
可适当稀释，使测定值落在标准曲线的线性范围内，避免蛋白质含量测定结果出现偏差。给定批次RT⁃S9
的蛋白含量为所测样品的平均值。
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GB/T 45238—2025
附　录　B
（资料性）
虹鳟肝亚细胞组分的表征
B.1　评估每批次RT⁃S9 催化Ⅰ相和Ⅱ相生物转化反应的能力，可用新制备或解冻的RT⁃S9 进行测定。
B.2　表B.1 中列出了测定Ⅰ相和Ⅱ相生物转化活性的常用标准测试方法和底物等信息，将测定结果
呈现在测试报告中。也可使用已知的受试物评估RT⁃S9 的活性。通常，将RT⁃S9 稀释至试验所需的
蛋白浓度，将结果以蛋白含量表示。
B.3　如果已知受试物可能的生物转化途径，可预先评估该途径，前提是具有标准化的测定方法。可用
的测定方法包括终点评估法（如30 min 时的酶活性）或动力学活性测定法。如果将结果与其他实验室
进行比较，需考虑试验条件的精确性，如底物浓度、蛋白浓度、孵育时间、评估终点或采样时间点等。
表B.1　用于表征RT⁃S9 酶活性的常用测定方法和底物
催化
阶段
Ⅰ相
Ⅱ相
活性测定
乙氧基香豆素O⁃脱乙基
（ECOD）
7⁃乙氧基试卤灵O⁃脱烷基化
（EROD）
7⁃甲氧基异酚唑O⁃脱烷基
（MROD）
7⁃羟基吩嗪酮二戊醚O⁃脱
烷基（PROD）
6β⁃羟基睾酮
氯唑沙宗6⁃羟基化
月桂酸11⁃羟基化
4⁃硝基苯基乙酸酯水解
CDNB⁃谷胱甘肽结合
对硝基苯酚葡萄糖醛酸化
酶
CYP1A
CYP1A
CYP1A
CYP2B
CYP3A
CYP2E1
CYP2K1
羧酸酯酶
GST
UGT
反应类型
O⁃脱乙基
O⁃脱烷基
O⁃脱烷基
O⁃脱烷基
芳香环羟基化
芳香环羟基化
长链脂族羟基化
水解
谷胱甘肽结合
葡萄糖醛酸化
底物
7⁃乙氧基香豆素
CAS No.：31005⁃02⁃4
7⁃乙氧基试卤灵
CAS No.：5725⁃91⁃7
甲氧基异酚唑
CAS No.：5725⁃89⁃3
7⁃羟基吩嗪酮二戊醚
CAS No.： 87687⁃03⁃4
睾酮
CAS No.：58⁃22⁃0
氯唑沙宗
CAS No.：95⁃25⁃0
月桂酸
CAS No.：143⁃07⁃7
4⁃硝基苯基乙酸酯
CAS No.：830⁃03⁃5
1⁃氯⁃2，4⁃二硝基苯（CDNB）
CAS No.：97⁃00⁃7
4⁃硝基苯酚
CAS No.：100⁃02⁃7
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附　录　C
（资料性）
酶促失活的虹鳟肝S9 亚细胞组分的制备
C.1　通常以酶促失活的RT⁃S9 作为底物清除试验的阴性对照，宜提前制备大量酶促失活的RT⁃S9，
并将其等量分装（如0.5 mL），冷冻保存。
C.2　如果酶促失活的RT⁃S9 阴性对照中受试物出现显著下降（大于20%），则可使用替代的阴性对照。
C.3　相关仪器包括：
a） 加热板；
b） 烧杯（水浴）；
c） 用于在水浴中煮沸RT⁃S9 的带盖容器；
d） 手持式组织匀浆器（如15 mL）（可选）；
e） 微量离心管（1.5 mL）。
C.4　材料为已知蛋白浓度的RT⁃S9。记录RT⁃S9 悬浮液的体积，并将悬浮液转移至受热安全的加盖
小瓶中（宜选用玻璃材质）。
C.5　烧杯加水后置于加热板上加热至沸腾，将装有RT⁃S9 悬浮液的加盖小瓶放入100 ℃沸水中，使悬
浮液缓慢沸腾15 min。
C.6　待RT⁃S9 冷却后，将其转移至量筒中，用100 mmol/L 磷酸钾缓冲溶液（见附录F 的表F.2）调节
体积以维持所需的浓度。如果观察到样品过量凝集，将其转移至手持式均质器中，对样品进行均化直
至溶液均匀（可选）。
C.7　将酶促失活的RT⁃S9 等分试样（如0.5 mL）转移至1.5 mL 微量离心管中，并在-20 ℃±1 ℃下
贮存直至使用。
C.8　在用于测试之前，用100 mmol/L 磷酸钾缓冲溶液（见附录F 的表F.2）稀释RT⁃S9 至所需浓度
（如10 mg/mL）。
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GB/T 45238—2025
附　录　D
（资料性）
初步试验反应条件的建立
D.1　预试验的主要目的是确定获得一级清除动力学的反应条件，建立采样时间表以获得受试物的清
除情况（与阴性对照相比有显著性差异），同时在终点时具备分析体系中残留受试物浓度的能力。用已
知Ⅰ相和Ⅱ相酶活性（见附录B）的RT⁃S9 进行预试验。
D.2　建立具有已知准确度、精密度和灵敏度的适当分析方法，用于测定试验介质中的受试物浓度，提
供受试物制备和储存的详细信息，获得试验介质中受试物的LOQ。
D.3　为获得受试物清除速率用于体外⁃体内外推模型，宜在测试过程中实现清除20%~90% 的受试
物，为达到此目标涉及的试验参数包括：蛋白浓度、受试物初始浓度和总孵育时间。
D.4　除了上述条件，为实现精确测定受试物的清除还需考虑以下因素：分析方法的灵敏度，设置内标
物的必要性，选择能够溶解受试物、引入体系和终止反应的溶剂，采用阳性对照（参比物）和阴性对照
（见附录C）。
D.5　底物清除试验（包括预试验）的蛋白浓度范围宜为0.25 mg/mL~2 mg/mL，常用浓度为1 mg/mL。
D.6　受试物初始浓度由获得一级动力学的需要与分析方法的灵敏度共同决定，可能存在需要测定的
浓度远低于初始浓度的情况（如在随后的时间点）。分析方法的灵敏度能准确测定所有时间点的受试
物浓度或受试物初始浓度的10%。
D.7　理论表明，获得一级动力学反应的可能性随着初始浓度降低至KM 以下而提高，但由于受试物分
析方法检出限制，不可能总是准确测定相关浓度，实践表明初始浓度处于低微摩尔/高纳摩尔范围内
（如不大于1.0 μmol/L）时可获得满意的结果，因此选择最低且合理的受试物浓度进行清除试验即可。
注： KM 指当反应速率达到1/2Vmax的底物浓度，Vmax指体系中底物达到最大饱和浓度时的反应速率。
D.8　为确定合适的受试物初始浓度，可采用以下3 种浓度进行尝试：
a） 1.0 μmol/L 或基于已有信息的其他浓度（如有）；
b） 假定50% 的受试物被清除，可被定量的最低浓度；
c） 处于a）和b）之间的浓度。
可使用决策树来最终确定受试物的初始浓度（见图D.1）。
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GB/T 45238—2025
图D.1　受试物初始浓度的选择
D.9　预试验包括的时间点通常是有限的（如6 min、30 min 和60 min）。正式试验中，首选可获得最快
速清除速率的受试物初始浓度，若几个受试物初始浓度得到的清除率相似，宜选取较高的浓度，因其降
低了对分析方法检出限的要求。
D.10　根据需要，采样总时长可能小于10 min，最长可达2 h，对于生物转化较慢的受试物，最长可达4 h，
宜包含6 个或更多的采样时间点。
D.11　获得的一级清除速率常数通常不与蛋白浓度或受试物浓度成正比，不宜将蛋白浓度提高至
2 mg/mL 以上，以免导致酶饱和。如果受试物的初始浓度使负责清除的酶活性达到饱和，则可能偏离
一级动力学反应。对于呈现经典米氏动力学的反应路径，这种饱和将导致零级清除，零级动力学的出
现表明需降低受试物初始浓度。
D.12　经对数转换的数据可能产生双指数动力学模式，包含一个“快”的初始清除阶段和紧随其后的一
个“慢”的终止清除阶段，该模式由产物抑制引起，其中包括产物随时间累积导致的酶活性抑制、辅因子
限制或酶饱和等，降低受试物初始浓度和蛋白浓度有助于解决该问题。
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GB/T 45238—2025
附　录　E
（资料性）
试验方法的建立
E.1　单瓶法
E.1.1　宜使用单瓶法测定易分析的受试物（如无挥发性、不黏附在容器壁上、在孵育体系中能迅速分
布），以获得可变性最小的试验结果，操作也最为简便。
E.1.2　在含有1 mL 悬浮液体系的单瓶中进行孵育试验，在规定的时间点从单瓶中取样（如100 μL）至
装有终止溶液的微量离心管中。
E.1.3　至少需要6 个时间点确定CLIN VITRO，INT，即试验需设置不少于6 个时间点（如2 min、10 min、20 min、
30 min、60 min、90 min 和120 min）（见图E.1）。
图E.1　单瓶法的独立运行图
E.2　多瓶法
E. 2.1　多瓶法是在多个独立小瓶中开展孵育，适用于挥发性或疏水性强的受试物。赫施曼瓶
（Hirschmann glass）可用于测定疏水性强的受试物。
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GB/T 45238—2025
E.2.2　可使用密闭的GC 瓶测定挥发性受试物，如添加200 μL RT⁃S9 混合物至GC 瓶，预孵育后盖上
带隔垫的盖子，使用注射器分别加入受试物和终止溶液，或添加受试物后直接盖紧小瓶，待反应后添加
终止溶液前打开小瓶。
E.2.3　每个独立小瓶至少包含2 次独立运行用于测定CLIN VITRO，INT，每次运行需满足以下条件：
a） 新鲜配制的受试物试验溶液；
b） 独立解冻的RT⁃S9，每次运行时，根据预先确定的瓶数准备活性RT⁃S9（如总瓶数为14，7 瓶
用于受试物测定，7 瓶用于参比物测定）和酶促失活的RT⁃S9（如7 瓶），添加受试物和参比物
至不同的小瓶中，分别在不同的时间点（如2 min、10 min、20 min、30 min、60 min、90 min 和
120 min）直接加入终止溶液（见图E.2）。
图E.2　多瓶法的独立运行图
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GB/T 45238—2025
附　录　F
（资料性）
缓冲溶液、辅因子、丙甲甘肽溶液的配制和RT⁃S9 的稀释
F.1　磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲贮备液的配制
磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲贮备液的配制见表F.1。
表F.1　磷酸氢二钾和磷酸二氢钾缓冲贮备液的配制
试剂
K2HPO4 缓冲贮备液
KH2PO4缓冲贮备液
浓度
mmol/L
100
100
称量
g
1.742
0.681
超纯水的体积
mL
100
50
保存温度和时间
4 ℃，最长贮存1 个月
4 ℃，最长贮存1 个月
F.2　磷酸钾缓冲溶液的配制
pH 7.8 100 mmol/L 的磷酸钾缓冲溶液的配制见表F.2，在11 ℃±1 ℃条件下可额外添加磷酸二氢
钾或磷酸氢二钾缓冲溶液将pH 调节至7.8。
表F.2　磷酸钾缓冲溶液的配制
试剂
pH 7.8
磷酸钾缓冲溶液
浓度
mmol/L
100
K2HPO4缓冲贮备液
mL
88
KH2PO4缓冲贮备液
mL
12
总体积
mL
100
pH，11 ℃
7.8
保存温度
和时间
4 ℃，最长贮存
1 个月
F.3　丙甲甘肽溶液的配制
F.3.1　丙甲甘肽贮备液（10 mg/mL）：小管中每毫克丙甲甘肽对应的甲醇添加量为0.1 mL，对小管进
行涡旋振荡，溶解后将贮备液等量（25 μL）分装至微量离心管中（如1.5 mL 微量离心管），在-20 ℃
±1 ℃条件下保存直至使用。
F.3.2　丙甲甘肽使用液（250 μg/mL）：将975 μL 磷酸钾缓冲溶液（见表F.2）添加至25 μL 10 mg/mL
丙甲甘肽贮备液中。
F.4　辅因子的配制
F.4.1　按照表F.3，分别提前称取一定量的3 种辅因子至小管（如1.5 mL 微量离心管）中，并于-20 ℃
±1 ℃下贮存。在试验开始当天，分别添加1 mL 预冷的磷酸钾缓冲溶液（见表F.2）至每个小管中，充
分混匀至完全溶解后，保存于冰上直至使用。
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GB/T 45238—2025
表F.3　辅因子的配制
辅因子
NADPH
UDPGA
GSH
浓度
mmol/L
20
20
50
称量
mg
16.67
12.93
15.37
磷酸钾缓冲溶液
mL
1
1
1
F.4.2　由于第4 个辅因子PAPS 的化学试剂纯度可能小于95%，需根据纯度对溶液配制进行调整。
宜在试验开始前，配制浓度为10 mmol/L 的PAPS 贮备液。
a） 通过添加磷酸二氢钾贮备液（见表F.1），将小体积（如25 mL）预冷的磷酸钾缓冲溶液（见
表F.2）的pH 调节至8.0（PAPS 在pH 8 下冷冻时最稳定，宜提前配制）；
b） 计算配制10 mmol/L 溶液所需PAPS 的质量，根据其试剂纯度进行调整，并考虑特定批次试
剂中水、锂和溶剂的百分含量，可按照公式（F.1）将所称量的PAPS 化学试剂的质量（g）转化
成PAPS 物质的量（mol），该公式中仅简单考虑了PAPS 试剂纯度及其含水量；
n =
m × w1 ×( 1 - w2 )
M …………………………（ F.1 ）
式中：
n ——PAPS 物质的量，单位为摩尔（mol）；
m ——PAPS 试剂的质量，单位为克（g）；
w1 ——PAPS 试剂的纯度， %；
w2 ——PAPS 试剂的含水率， %；
M ——摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol），PAPS 的摩尔质量为507.26 g/mol。
c） 将PAPS 溶解于精确体积的pH 8.0 预冷磷酸钾缓冲溶液（F.4.2）中，得到10 mmol/L 的
PAPS 贮备液，将其等量分装（50 μL）至预冷的微量离心管中，立即置于-80 ℃±1 ℃下贮存；
d） 在试验开始当天，将1 分装管中的50 μL 10 mmol/L PAPS 贮备液解冻，并加入450 μL
pH8.0 的磷酸钾缓冲溶液（F.4.2）稀释至1 mmol/L 的试验浓度。
F.5　辅因子混合物的配制
F.5.1　在预孵育前，用磷酸钾缓冲溶液配制NADPH、UDPGA、GSH 和PAPS 等辅因子。
F.5.2　按照以下方法混合所有的辅因子，得到的辅因子混合物在加入反应瓶前，需经漩涡充分混匀。
a） 500 μL 20 mmol/L NADPH；
b） 500 μL 20 mmol/L UDPGA；
c） 500 μL 50 mmol/L GSH；
d） 500 μL 1 mmol/L PAPS。
F.6　RT⁃S9 的稀释
F.6.1　按以下步骤将活性和酶促失活的RT⁃S9 稀释至试验所需蛋白浓度。用磷酸钾缓冲溶液将活性
和酶促失活RT⁃S9 稀释至10 倍试验蛋白浓度，从而以100 μL 的量添加到反应体系中以获得适合的
蛋白浓度。
F.6.2　计算获得RT⁃S9 试验蛋白浓度所需的磷酸钾缓冲溶液体积。例如：冷冻管中RT⁃S9 蛋白浓度
为23.6 mg/mL，体积为150 μL，由此计算得到冷冻管中的蛋白总量为3 540 μg，加入204 μL 磷酸钾缓
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冲溶液（见表F.2）后获得10 mg/mL 的试验蛋白浓度（反应体系目标浓度是1 mg/mL）。
F.6.3　图F.1 以7 mL 闪烁管为例，添加受试物前混合孵育体系组成的示意图。
图F.1　以7 mL 闪烁管为例的混合孵育体系（添加受试物前）组成示意图
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参考文献
[1]　OECD Guidelines for The Testing of Chemicals No.319B　Determination of in vitro intrinsic
clearance using rainbow trout liver S9 sub⁃cellular fraction（ RT⁃S9）（2018）
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