CCS A80
中华人民共和国国家标准
GB/T45221—2025
化学品 EASZY 试验 利用转基因tg
(cyp19a1b:GFP )斑马鱼胚胎通过
雌激素受体检测内分泌活性物质
Chemicals—EASZYassay—Detectionofendorineactivesubstances,acting
throughestrogenreceptors,usingtansgeictg (cyp19a1b :GFP )zebrafish
embryos
2025-01-24发布2025-05-01实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发布
目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
引言………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语和定义、缩略语……………………………………………………………………………………… 1
4 试验原理………………………………………………………………………………………………… 2
5 受试物信息……………………………………………………………………………………………… 3
6 能力验证化学品………………………………………………………………………………………… 3
7 试验准备………………………………………………………………………………………………… 4
8 试验程序………………………………………………………………………………………………… 6
9 数据分析和结果评价…………………………………………………………………………………… 7
10 质量保证与质量控制…………………………………………………………………………………… 8
11 结果报告………………………………………………………………………………………………… 8
附录A (资料性) tg c(yp19a1b G:FP )基因构造……………………………………………………… 10
附录B(资料性) 通过诱导GFP表达来测定化学品产生雌激素活性的途径……………………… 11
附录C(资料性) EASZY试验流程…………………………………………………………………… 13
附录D(资料性) EASZY试验成像分析……………………………………………………………… 15
附录E(资料性) 96h后转基因斑马鱼体内荧光成像………………………………………………… 16
附录F(资料性) 转基因斑马鱼的体内成像:广角荧光显微镜……………………………………… 18
附录G (资料性) 转基因斑马鱼的体内成像:ImageJ中图像分析宏的使用示例…………………… 19
附录H (资料性) 数据报告和分析……………………………………………………………………… 24
附录I(资料性) 数据统计分析的流程图……………………………………………………………… 31
附录J(资料性) EASZY试验中的浓度-反应关系示例……………………………………………… 32
参考文献…………………………………………………………………………………………………… 38
Ⅰ
GB/T45221—2025
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。
本文件起草单位:广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)、生态环境部固体废物
与化学品管理技术中心、广东省生物技术研究院(广东省实验动物监测中心)、中检科健(天津)检验检测
有限责任公司、清华大学、完美(广东)日用品有限公司。
本文件主要起草人:梅承芳、许玫英、许玉洁、李建军、窦从从、周小红、丰时运、王鹏、高亮、刘洪英、
曾国驱、刘超武、周丽丽、刘纯新、肖亿金、高彩霞、袁艺。
Ⅲ
GB/T45221—2025
引 言
EASZY[利用转基因tg (cyp19a1b :GFP )斑马鱼胚胎通过雌激素受体检测内分泌活性物质]试验
是一种基于机制的体内筛选试验,旨在通过诱导cyp19a1b 启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)的表
达,检测作为雌激素受体激动剂的内分泌活性物质。EASZY 试验可用于检测化学物质对转基因tg
(cyp19a1b :GFP )斑马鱼胚胎暴露96h的雌激素活性。附录A 描述了用于建立转基因品系的基因
结构。
cyp19a1b 基因编码的脑芳香化酶,是一种负责从雄激素中合成雌激素的酶。在鱼类中,cyp19a1b
基因的表达仅限于放射状胶质细胞,它是从胚胎期到成年期产生新神经元的祖代细胞。cyp19a1b 基因
的转录需要被激活的雌激素受体(ERs)、结合于雌激素反应元件(EREs)的配体-ER 复合物以及位于
cyp19a1b 基因启动子区域的半个EREs共同参与。cyp19a1b 调控还需要与胶质细胞x反应元件
(GxRE)结合的胶质细胞特异性因子与ERE序列的协同作用。GxRE在cyp19a1b 基因的细胞特异性
调控及其受雌激素的调控中发挥着重要作用。
除雌激素外,类固醇雄激素也可调控cyp19a1b 基因的转录活性。对于可芳构化的雄激素(如睾
酮),这种调控预示着它们可被芳构化为雌激素,随后与ERs结合并诱导cyp19a1b 的表达。而不可芳构
化的雄激素中,11酮睾酮无法诱导cyp19a1b 的表达;5α-二氢睾酮(DHT)则已被证实具有雌激素样活
性,它通过ER依赖性途径诱导cyp19a1b 的表达。这可能是由于DHT通过3β-羟基类固醇脱氢酶的作
用转化为一种已知的雌激素类固醇———β-二醇(见附录B)。
在斑马鱼胚胎的端脑、视前区和下丘脑中可检测到ERβ1和ERβ2mRNA 的表达,但对于本文件中
所处发育阶段的斑马鱼胚胎,在其大脑中未检测到ERα的转录体。这表明ERβ1和/或ERβ2可驱动芳
香化酶B的表达,其中斑马鱼ERβ2比ERα对天然和合成雌激素具有更高的亲和力,这与已报道的人
ERs亚型对这些物质的亲和力不同。
在转基因tg(cyp19a1b :GFP )斑马鱼中,GFP完美地模拟了斑马鱼大脑中内源性cyp19a1b 的表
达。因此,测量tg(cyp19a1b :GFP )胚胎中的报告基因GFP,可用于评估化学品诱导cyp19a1b 基因表
达的能力。
EASZY试验技术已成功应用于测试一批化合物,包括天然和合成激素、药物、农药、工业化学
品,用于评估它们在tg(cyp19a1b :GFP )斑马鱼胚胎中诱导GFP的能力。
经济合作与发展组织(OECD)修订后的指南文件No.150已将EASZY 试验确定为OECD 内分泌
评估概念框架中的3级鱼类筛选试验,即一种提供关于特定内分泌干扰机制/通路数据的体内试验。作
为3级筛选试验,EASZY试验可通过是否诱导由ER调控的cyp19a1b 启动子驱动的GFP,来识别ER
信号通路上的活性和非活性受试物质。试验数据不宜用于化学品的风险评估。
Ⅳ
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化学品 EASZY 试验 利用转基因tg
(cyp19a1b:GFP )斑马鱼胚胎通过
雌激素受体检测内分泌活性物质
1 范围
本文件描述了利用转基因tg(cyp19a1b :GFP )斑马鱼胚胎通过雌激素受体检测内分泌活性物质的
EASZY试验方法,包括试验原理、受试物信息、能力验证化学品、试验准备、试验程序、数据分析和结果
评价、质量保证与质量控制、结果报告。
本文件适用于筛选和评估化学品中的内分泌活性物质。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T13266 水质 物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法
3 术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
激动剂 agonist
能结合并激活特异性核受体,诱导核受体调控基因转录活性的化学物质或配体。
3.1.2
拮抗剂 antagonist
能结合核受体,阻断或者抑制激动剂配体介导的反应的化学物质或配体。
3.1.3
活性受试物 activetestchemical
能显著诱导GFP表达且对GFP的最低平均诱导水平大于空白对照组两倍的受试化合物。
3.1.4
脑芳香化酶 brainaromatase
由cyp19a1b 基因编码,负责雌激素的内源性合成的酶。
3.1.5
效应浓度 effectconcentration;ECx
在给定测试周期内,与对照组相比,导致胚胎荧光强度降低x%的受试物浓度。
3.1.6
雌激素活性 estrogenicactivity
受试物模拟17β-雌二醇作用的能力,以雌激素受体特异性的方式激活内源性cyp19a1b 和/或由
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cyp19a1b 启动子驱动的表达GFP的能力。
3.1.7
诱导倍数 foldinduction
单个胚胎荧光强度与空白对照组胚胎平均荧光强度的比值。
3.1.8
非活性受试物 inactivetestchemical
GFP平均表达强度不大于对照组的两倍,对GFP表达没有显著影响的物质。
3.1.9
荧光强度 integrateddensity
感兴趣区中所有像素强度的总和。
3.1.10
胚胎最大耐受浓度 maximumtoleratedconcentration;MTC
试验结束时,每个平行的胚胎死亡数不超过1的受试物的最高浓度。
3.1.11
能力验证化学品 proficiencychemical
用于表明实验室具有标准化测试技术能力的一系列参比物。
3.1.12
相关性 relevance
用于描述试验方法与目标效应的关系,以及对特定效应是否具有意义和作用。
注:用于判断试验方法是否能正确测定或预测所关注的生物学效应及其准确性,同时考虑了试验方法的准确性。
3.1.13
tg(cyp19a1b:GFP )
转基因斑马鱼在cyp19a1b 启动子控制下稳定表达绿色荧光蛋白的报告基因。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Dpf:受精后天数(Daypost-fertilization)
DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)
EE2:17α-乙炔雌二醇(17α-ethinylestradiol)
E2:17β-雌二醇(17β-estradiol)
ER:雌激素受体(EstrogenReceptor)
ERE:雌激素反应元件(EstrogenResponseElement)
GFP:绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein)
GxRE:胶质细胞x反应元件(Glialx-ResponsiveElement)
Hpf:受精后的小时数(Hourspostfertilization)
ROI:感兴趣区(RegionofInterest)
4 试验原理
将受精的斑马鱼卵(受精4h内)在半静态条件下暴露于受试物中96h,每24h更新一次试验溶
液。试验结束时,使用荧光显微镜测定每个新孵化胚胎的荧光,采用图像分析软件定量GFP的荧光
强度。
2
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5 受试物信息
受试物信息包括:
a) 结构式;
b) 相对分子质量;
c) 纯度;
d) 在试验条件下的稳定性;
e) 解离常数(pKa);
f) 有机碳分配系数(Koc);
g) 正辛醇/水分配系数(Pow);
h) 蒸气压,并计算亨利常数,预测受试物挥发可能造成的损失;
i) 快速生物降解性;
j) 分析方法及相关参数(如准确度、精密度、检测限、定量限、特异性和线性范围)。
6 能力验证化学品
在常规开展EASZY试验之前,应使用表1中列出的化学品来验证实验室的技术熟练度,这些化学
品包括EASZY试验中的阳性物质和阴性物质。阳性物质具有适当的雌激素活性范围,并涵盖了GFP
的不同诱导途径,如雌激素受体激动剂配体、雌激素前体、可芳构化和不可芳构化的化合物。表1提供
了不同化学品的敏感性范围。
实验室应定期开展能力确认试验,以验证转基因胚胎的响应性。每年应用EE2或E2进行一次正
式试验并统计EC50,推荐测试浓度和EC50值范围见表1。当繁育条件(如试验用水、环境条件、新一代
亲本)发生显著变化时,宜重新开展能力确认试验。每个常规试验包括一个阳性对照,如终浓度为
14.8ng/L(可引起GFP最大诱导倍数的最低浓度)的EE2。试验结束时,与溶剂对照组相比,阳性对照
的GFP平均诱导倍数应不小于9。如果EE2对GFP的诱导倍数低于9则试验结果无效。此时,宜考
虑以下原因并采取相关措施:
a) 技术原因导致阳性对照出现低倍数诱导,如使用了超过其寿命的荧光激发光源导致光密度
降低;
b) 验证贮备液的浓度,必要时更新贮备液;
c) 采用EE2开展正式试验以获得其对新亲本所产胚胎的浓度-反应曲线,EC50应在表1所示范
围内。
表1 能力验证化学品(包括阳性物质和阴性物质)及其测试浓度和EC50范围
化学品CASNo. 作用方式
预期
效应
测试浓度范围EC50
平均值最小值~最大值
17α-乙炔雌二醇57-63-6 雌激素
受体激动剂
阳性0.18ng/L~29.6ng/L 4.4ng/L 2.4ng/L~8.3ng/L
17β-雌二醇50-28-2 雌激素
受体激动剂
阳性32.7ng/L~2723ng/L 404ng/L 153ng/L~781ng/L
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表1 能力验证化学品(包括阳性物质和阴性物质)及其测试浓度和EC50范围(续)
化学品CASNo. 作用方式
预期
效应
测试浓度范围EC50
平均值最小值~最大值
双酚A 80-05-7 雌激素
受体激动剂
阳性27.3μg/L~2282μg/L 856μg/L 571μg/L~1141μg/L
对特辛基苯酚140-66-9 雌激素
受体激动剂
阳性2.5μg/L~206μg/L 51μg/L 37μg/L~85μg/L
炔诺酮68-22-4
雌激素受体
激动剂
(雌激素前体)
阳性0.3μg/L~29.8μg/L 2.5μg/L 1.2μg/L~4.2μg/L
睾酮58-22-0 可芳构化
雄激素
阳性34.6μg/L~2884μg/L 213μg/L 118μg/L~389μg/L
11-酮睾酮564-35-2 不可芳构化
雄激素
阴性36μg/L~3024μg/L — —
地塞米松50-02-2 糖皮质激素
受体激动剂
阴性47μg/L~3924μg/L — —
7 试验准备
7.1 仪器设备
除常规实验室仪器设备外,还需要以下设备:
a) 双目显微镜;
b) 荧光显微镜,配备10×物镜,GFP滤光片[激发滤光片470nm(波段450nm~490nm),发射
滤光片525nm(波段500nm~550nm)]和荧光相机;
c) 计算机与图像分析软件;
d) 由惰性材料(如玻璃)制成的暴露容器(如结晶皿、培养皿),容器的容积应符合推荐的承载量需
求(15mL~25mL试验溶液);
e) 恒温培养箱或保温室,温度维持在27℃±2℃范围内;
f) 用于满足性成熟的转基因斑马鱼产卵的大容量容器;
g) 产卵盘,用网(如绿色塑料网)覆盖的玻璃托盘;
h) 无菌巴斯德移液管,用于从产卵盘中收集卵,将卵转移到暴露容器中;
i) 印涂了特氟龙的免疫荧光载玻片,用于在荧光显微镜下测定活体胚胎的GFP;
j) 测定电导率、pH 和溶解氧的设备。
7.2 试剂
用于胚胎麻醉和安乐死的试剂如下:
a) 本佐卡因或三卡因作为麻醉剂,如果使用其他麻醉剂应提前评估它们是否对GFP有影响;
b) 漂白剂溶液(61.5g/L次氯酸钠溶液),用于对斑马鱼胚胎实施安乐死。
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7.3 试验生物
7.3.1 试验生物的驯养
根据附录A 中描述的基因结构构建转基因tg(cyp19a1b :GFP )斑马鱼。转基因tg(cyp19a1b :
GFP )斑马鱼是一种跨代表达GFP的纯合子系,转基因向后代的传递率稳定,且跨代转基因的表达和转
基因胚胎对参比激动剂的响应没有任何改变。转基因纯合子tg(cyp19a1b :GFP )品系的培养条件与野
生型斑马鱼相同。转基因成鱼定期内交以获得纯合子胚胎。为了保证tg(cyp19a1b :GFP )斑马鱼遗传
背景的多样性,每五代将转基因斑马鱼与野生型斑马鱼进行一次异交。通过观察携带该转基因的后代
中GFP的组成性表达,选择转基因胚胎并用于维持种系。
采用未经化学品暴露的转基因斑马鱼获取鱼卵。亲鱼在产卵前2个月不应接受任何药物(急性或
预防性)治疗且无明显的感染和疾病症状。亲鱼的养殖条件为27℃±2℃,光周期为12h~16h,承载
量宜为1尾鱼/L。将亲鱼饲养在活性炭过滤水或任何对鱼类健康和繁殖有益的水中。宜饲喂干片饲
料(每天最大喂食量为鱼重的3%,每天3次~5次)、未被污染的丰年虾(卤虫)无节幼体或适当大小的
溞类。提供活食有利于环境丰容,因此宜提供活食。
7.3.2 试验胚胎的获取
通过亲鱼集群产卵的方式获取转基因斑马鱼卵。将60尾~100尾成年的转基因雄鱼和雌鱼同时
养殖在繁殖箱里,雄鱼与雌鱼的性别比为1∶1~2∶1。如不采用集群产卵,也可收集来自不同的成对
亲鱼的卵。若采用配对产卵的方式,在收集鱼卵前,每个个体产卵的受精率应不低于70%,否则将不应
用于试验。
在试验前一天,将一个覆盖绿色网格(由惰性材料制成,网格大小合适,以保护胚胎不被亲鱼吃掉)
的玻璃托盘放置在水箱中。第二天早上,亲鱼由于受到光照刺激开始产卵。在光照开始后的90min~
120min内,小心地将装有胚胎的托盘从水箱中取出,将胚胎从玻璃托盘转移到装有试验用水的玻璃容
器中,并移除多余的有机物(食物、粪便)。使用双目显微镜选择受精4h内且发育正常的受精卵,转移
到玻璃容器中,承载量为1个胚胎/2mL。
7.4 试验容器
孵化过程在由惰性材料(如玻璃)制成的暴露容器中进行,暴露容器的容量应为15mL~25mL。
7.5 试验用水
重组水(按照GB/T13266配制)或水质良好的地表水/井水。试验前对试验用水进行曝气,以达到
最大氧饱和度。试验用水pH 值为6.5~8.5,电导率为300μS/cm ~700μS/cm,温度为27℃±2℃。
7.6 试验溶液
通过稀释贮备液制备设定浓度的试验溶液。用搅拌或超声处理等机械方式将受试物混合于试验用
水中制备贮备液。有时可能需要使用有机溶剂或分散剂以配制适当浓度的贮备液,但宜避免使用此类
化学品。如果使用溶剂,其在试验溶液中的终浓度应不高于0.1mL/L,且除阴性对照之外的所有试验
组中均等量添加。DMSO 是一种合适的溶剂,0.1mL/LDMSO 溶剂对照与阴性对照对GFP的表达无
显著差异。使用溶剂时,试验溶液的详细制备方法见附录C。
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8 试验程序
8.1 试验条件
8.1.1 暴露条件
将暴露容器置于人工气候培养箱中,温度为27℃±2℃,每天12h~16h光照。在试验开始和每
次更新试验溶液时,溶液的溶解氧浓度应不低于饱和浓度的80%。每24h更换空白对照组和试验组中
的溶液。
8.1.2 喂食
试验期间不进行喂食。
8.1.3 试验周期
EASZY试验从受精4h内的胚胎开始,暴露96h后终止。
8.2 试验浓度
8.2.1 预试验
最高试验浓度根据受试物在试验用水中的最大溶解度、胚胎最大耐受浓度或最高试验浓度
100mg/L来设定,以最低者为准。如有来自其他水生物种(包括鱼类胚胎)的急性毒性数据,定量构效
关系(QSAR)数据或其他交叉参照数据,可通过专业判断来确定最大试验浓度。
如缺乏受试物相关急性毒性数据,应对tg(cyp19a1b :GFP )斑马鱼胚胎开展预试验,以初步评估毒
性。按照几何级数至少设置3个试验浓度,相邻浓度间隔系数不超过10。每个试验浓度和对照只设置
一个包含10个胚胎的平行。预试验中每个暴露容器含有25mL试验溶液。
8.2.2 正式试验
在正式试验中,至少设置3个试验浓度,间隔系数宜为3~10。更多的试验浓度有利于建立一个完
整的浓度-反应关系,用于确定效应浓度(ECx )。将7个受精胚胎放置于一个含有15mL~25mL试验
溶液的暴露容器中,试验组和空白对照组各设置3个平行。在试验条件下将受精卵随机分布。每个暴
露容器贴有适当且清晰的标签,并盖上玻璃盖。
设置的最高浓度应能引起GFP的最大表达,最低浓度的荧光与对照组相比应无显著性差异。受试
物对GFP表达的最大效应可以不大于阳性对照。受试物各浓度组的每个平行中胚胎死亡数均应不超
过1。如果不符合上述要求,在确定浓度-反应关系时排除该试验浓度的数据。
8.3 对照组
对照组的试验条件包括。
a) 阴性对照(空白对照):斑马鱼胚胎暴露于试验用水中。
b) 阳性对照:斑马鱼胚胎暴露于终浓度为14.8ng/L 的EE2中,阳性对照所用的贮备液为用
DMSO配制的1000倍浓缩液,在-20℃中避光保存。为确保试验结果的可重复性,EE2贮
备液的保质期不应超过1个月。
c) 溶剂对照(如有):溶剂的最大浓度不应超过0.1ml/L或100mg/L,试验前确定溶剂不会显著
诱导GFP表达。溶剂对照与阴性对照对GFP的表达应无显著差异,否则重新试验。如果存
在特殊数据需求或监管部门的相关要求,可省略阴性对照,仅用溶剂对照进行测试和评估。
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GB/T45221—2025
8.4 浓度分析
试验采用半静态更新的暴露方式,记录受试物浓度的稳定性。至少对受试物的最高和最低浓度进
行分析,宜分析所有试验浓度。在暴露期间至少测定一次新制备的试验溶液(0h)和更新试验溶液前
(24h±2h)其中一个平行的受试物浓度。受试物的浓度应在24h内保持在理论浓度的80%~120%
范围内。可在试验开始前用试验溶液对试验容器进行预暴露处理(至少24h),以尽量减少吸附造成的
浓度损失。如果浓度不能保持在理论浓度的80%~120%范围内,结果用测定浓度的几何平均值表示。
8.5 观察和溶液的更新
每天更新对照组和试验组的溶液。将旧溶液移除后,立即在暴露容器中加入新制备的溶液。更换
溶液时,注意避免胚胎脱水。更新溶液前测定新制备的对照组和试验组溶液的pH、溶解氧浓度、电导
率和温度。
暴露期间,每天检查胚胎的死亡率,并移除死亡胚胎。在暴露结束时,计算对照组和试验组的累积
死亡率并进行报告。从48h开始直至试验结束,每天观察试验组和对照组中的胚胎孵化情况,并记录
观察结果,胚胎观察见OECD No.236。孵化的推迟会减少鱼类在受试物中的暴露时间,从而限制
EASZY试验的检测效力。报告任何其他有关鱼类发育的相关观察结果和数量,如水肿、尾部畸形等。
8.6 荧光测定
暴露结束时,用滴管小心地将已孵化的斑马鱼从暴露容器转移到多孔荧光疏水载玻片上(每个孔
1个)。一个24孔的荧光载玻片可转移同一浓度组的所有胚胎。此时可麻醉胚胎也可不麻醉。如果实
施麻醉,则直接在暴露容器中加入50mg/L的苯佐卡因或150mg/L的三卡因。麻醉5min后,将孵化
的胚胎转移至载玻片上。观察荧光载玻片每个孔中的存活斑马鱼胚胎。
对每个斑马鱼胚胎的背侧拍照,保证胚胎的位置合适,以确保不同胚胎之间的GFP表达具有可比
性(见附录D和附录E)。如果位置不正确(腹侧或侧视图),用移液管顶端重新定位胚胎,从背侧观察胚
胎,过程中可使用固定介质(如甲基纤维素)。在该发育阶段,斑马鱼胚胎的色素沉着具有个体差异,但
这并不影响GFP的测定,也不影响试验响应。如果出现严重的畸形(如严重的卵黄囊水肿和/或心包水
肿、严重的头部畸形),可能难以正确定位,并影响荧光的准确测定。定位正确后,对每个胚胎的头部进
行拍照。在试验前确定荧光显微镜的参数,并在不同试验之间保持相同参数,以便进行数据比较。荧光
参数的设置和图像分析的定量分别见附录F和附录G。
8.7 试验结束
在试验结束时,采用苯佐卡因麻醉联合低温休克致死的方法对斑马鱼胚胎进行安乐死,也可采用添
加漂白剂溶液(61.5g/L次氯酸钠溶液)的方法。
9 数据分析和结果评价
9.1 数据分析
对每个胚胎进行图像分析后,将结果记录在数据表中。以斑马鱼的荧光强度(见附录G)相对空白
对照或溶剂对照(如有)的诱导倍数来对斑马鱼个体的荧光进行定量。附录H 提供了数据报告和分析
示例。
通 过方差分析(ANONA)对试验组和对照组各个平行的效应均值进行比较以确定受试物的潜在活
性。采用适当的统计方法对阴性对照组和溶剂对照组(如有)之间的GFP进行统计分析。如果无法满
足正态分布(Shapiro-Wilk’s检验)或者方差齐性(如Bartlett’s检验或Levene’s检验)等参数方法的假
7
GB/T45221—2025
设要求,在进行单因素方差分析之前,宜进行数据转换以满足方差齐性。对诱导倍数进行对数变换是首
选的数据转换方法。方差分析的事后检验取决于浓度-反应关系的单调性。基于两两多重比较的Dunnett’s
检验(参数)或经过Holm-Bonferroni调整后的Dunn检验/Mann-Whitney检验(非参数)均可用
于非单调的浓度-反应关系。也可使用其他统计检验方法,如浓度-反应关系接近单调时,可用非参数统
计方法如Jonckheere-Terpstra检验或Williams检验。数据统计分析的流程图见附录I。
EASZY试验可获得活性受试物产生显著诱导效应的最低浓度和产生GFP最大诱导效应的浓度。
如果试验浓度的数量允许建立完整的浓度-反应曲线,可推导引起最大效应50%的浓度(EC50)及其
95%置信限,EASZY试验能较为准确地测定雌激素化学物质的EC50。
9.2 结果评价
除了确定统计学上的显著效应之外,还要考虑效应的大小,以确定受试物是否具有雌激素活性。这
有助于避免EASZY试验中潜在的假阳性结果。在前期的验证试验中,已确立了最小为2倍的诱导阈
值,一些非活性受试物偶尔会产生显著效应,但其诱导倍数不大于2。
附录J提供了同时利用统计分析和2倍诱导阈值分析浓度-反应曲线的示例,以及对EASZY 试验
中受试物活性的相关解释。如果某种受试物对GFP的诱导与空白对照相比差异显著且低于2,则不认
为该受试物具有活性(见附录J),此时应重复试验。如果在新的试验中,受试物仍然引起显著性差异且
平均诱导倍数不大于2,则该受试物不能归类为活性物质。相反,如果某种受试物的诱导效应不显著且
平均GFP诱导倍数大于2,也应重复试验(见附录J)。如果仍得到类似的数据,则仅依据EASZY 试验
结果无法得出有效结论。
10 质量保证与质量控制
在试验结束时满足以下条件,试验结果有效:
a) 所收集胚胎的受精率不低于70%;
b) 试验结束时,空白对照组和溶剂对照组(如有)每个平行中死亡胚胎数不大于1;
c) 试验结束时,空白对照组和溶剂对照组(如有)的孵化率不低于90%;
d) 与溶剂对照组相比,阳性参比物(如14.8ng/L的EE2)的荧光强度诱导倍数不低于9。
11 结果报告
试验报告应包括以下内容。
a) 受试物:
———物理性状、水溶解性及相关的物理化学性质;
———化学标识,如国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)名称或CAS名称、CAS号、简化分子
线性输入规范(SMILES)码或国际化合物标识(InChI)码、结构式、纯度等信息,在适当情
况下提供杂质的化学鉴别信息。
b) 试验生物:学名、种系、来源、胚胎产生和收集方法以及随后受精胚胎的处理方式。
c) 试验条件:
———试验设计,空白对照的类型、浓度数量和容器种类;
———光照周期和光照强度;
———鱼驯养用水的参数指标,如pH、溶解氧浓度、电导率等;
———在试验开始时和更换试验溶液前,试验溶液的溶解氧浓度、pH、温度和电导率;
———受试物贮备液和试验溶液的配制方法、更换频率;
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GB/T45221—2025
———选择和使用溶剂的理由(如有);
———是否存在任何可见的非溶解性受试物(如有);
———试验溶液的理论浓度和受试物实测浓度,以及浓度分析方法的回收率和检测限。
d) 试验结果:
———胚胎受精率;
———对照组和试验组的死亡率(每个平行的死亡率及平均值);
———对照组和试验组的孵化率(每个平行的孵化率及平均值);
———阳性对照中GFP表达的均值;
———所有试验组和对照组中GFP表达的均值;
———对GFP数据的统计分析和处理;
———试验期间,对GFP表达无影响的最大受试物浓度;
———计算得到的具有统计学差异的最低受试物浓度;
———观察到最大诱导效应的受试物浓度和诱导倍数;
———GFP表达的浓度-反应曲线图;
———形态和生理异常的发生率和相关描述(如有);
———试验过程中可能影响结果的事件;
———应报告对本文件的所有偏离及相关解释;
———应根据有效性和判定标准来解释受试物的潜在雌激素活性,并对结果进行讨论;
———EC50(如有)。
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附 录 A
(资料性)
tg(cyp19a1b:GFP )基因构造
转基因tg( cyp19a1b :GFP )斑马鱼品系已被构建,在该模型中,绿色荧光蛋白(GFP)的表达受3.4kb
的斑马鱼cyp19a1b 近端启动子调控,随后是第一个外显子、第一个内含子,以及包含天然翻译起始位点
的第二个外显子的起点(基因结构见图A.1)。
该结构包含3424bp的5’侧翼区、54bp的未翻译外显子Ⅰ(exon Ⅰ)、1698bp的内含子Ⅰ
(intronⅠ)和20bp的未翻译外显子Ⅱ(exon Ⅱ),随后是天然翻译起始位点。将含有SV40polyA 序
列的GFP基因(polyA)通过9-aa连接子融合到cyp19a1b 的前10个氨基酸上,ATG为翻译起始位点。
图A.1 用于生产转基因斑马鱼的tg(cyp19a1b:GFP )结构图
10
GB/T45221—2025
附 录 B
(资料性)
通过诱导GFP表达来测定化学品产生雌激素活性的途径
B.1 通过诱导斑马鱼cyp19a1b 启动子驱动的GFP表达来测定化学品产生雌激素活性的途径,受试物
产生雌激素活性的途径示意图如图B.1所示。
图B.1 受试物产生雌激素活性的途径示意图
B.2 根据受试物诱导GFP表达(受斑马鱼雌激素受体调控cyp19a1b 启动子驱动)的能力来揭示受试
物的雌激素活性。其中包括化学品作为激动剂与雌激素受体直接结合,或化学品代谢后再与雌激素受
体结合(雌激素前体)。一些可芳构化的雄激素已被证明可通过芳构化为雌激素在EASZY 试验中表现
出活性,而二氢睾酮(DHT)作为一种不可芳构化的雄激素也在EASZY 试验中表现出活性,这表明其
可能通过其他类固醇生成途径转化为已知的具有雌激素活性的DHT代谢物5α-雄甾烷-3β和17β-二醇
(β-二醇)。
B.3 一系列天然与合成雌激素以及属于不同化学家族的化学品诱导GFP的能力,已经在转基因tg
(cyp19a1b :GFP )胚胎模型中进行了测定。实验室间比对验证试验表明,化合物作为激动剂直接与雌
激素受体结合,以特异性雌激素受体介导的方式诱导GFP。EASZY 试验可测定和分辨从低浓度
(ng/L)到高浓度(mg/L)范围起作用的雌激素受体激动剂化合物(如合成和天然类固醇激素属于低浓
度作用物质,双酚类为高浓度作用物质)。一些不可芳构化的雄性激素也具有活性,如17β-群勃龙(17β-
trenbolone)。17β-群勃龙的雌激素活性可能反映了其在高浓度下结合和激活雌激素受体的能力。在一
些计算机模拟和体外ER转录激活试验中,17β-群勃龙已被定义为阳性物质。此外,在大鼠的体内试验
中,17β-群勃龙已被证明在大脑水平上通过雄激素受体(AR)和ER介导过程来改变蛋白质的表达。这
11
GB/T45221—2025
些体外和体内研究的数据表明,在包括斑马鱼胚胎在内的不同脊椎动物模型中,17β-群勃龙作为激动剂
可与雌激素受体结合,在体外和体内诱导雌激素受体反应。
B.4 EASZY试验还可用于检测在诱导GFP之前需要生物转化的化合物。一些需要代谢激活成雌激
素代谢物的化合物已被证明能以雌激素受体依赖(ER-dependent)的方式来诱导GFP。如甲氧氯
(methoxychlor),其雌激素活性源于雌激素代谢物,如2,2-二(对羟基苯基)-1,1,1-三氯乙烷(HPTE)。
此外,19-去甲睾酮合成的孕激素已被证明在发育中的斑马鱼大脑中以雌激素受体依赖(ER-dependent)
的方式来诱导GFP。虽然斑马鱼模型中的代谢特性尚不清楚,但已知这些化合物在哺乳动物体内可生
物转化为雌激素衍生物。
B.5 在EASZY试验中,可芳构化的雄性激素,如睾酮(testosterone)和甲基睾酮(methyltestosterone),已被
证明可诱导GFP。cyp19a1b 的雄激素调节是通过雌激素受体严格介导的,既不涉及AR也不涉及雄激
素反应元件,而是由于睾酮和甲基睾酮分别芳构化为雌二醇(estradiol)和甲基雌二醇
(methyltestradiol)。此外,部分不可芳构化的雄激素已被证明以雌激素受体依赖(ER-dependent)的方
式来诱导GFP,如5α-二氢睾酮(DHT)。体外研究表明,DHT对cyp19a1b 的转录刺激是发生在斑马鱼
雌激素受体而非雄激素受体存在的情况下。相反,另一种不可芳构化雄激素11酮-睾酮(11Keto-testosterone,
11-KT)未能诱导cyp19a1b 基因的转录活性。在体内研究中,DHT 仍是斑马鱼大脑中
cyp19a1b 表达的有效诱导剂,11-KT则不是。在体内研究中,DHT的雌激素活性可被ICI182780(一
种ER拮抗剂)阻断,而氟他胺(Flutamide,一种AR 拮抗剂)却不能。DHT 的雌激素活性可能是由于
其通过3β-羟基类固醇脱氢酶的活性转化为β-二醇。在体外研究中,β-二醇在斑马鱼雌激素受体存在的
情况下诱导脑芳香化酶的转录活性;而在体内研究中,β-二醇诱导脑芳香化酶表达的效应被ICI182780
阻断,再次表明有被激活的雌激素受体参与了该诱导作用。总之,11-KT 在刺激芳香化酶B表达上完
全无效,但DHT很可能通过3β-羟基类固醇脱氢酶活性,经生物转化为β-二醇,从而诱导雌激素效应。
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附 录 C
(资料性)
EASZY 试验流程
C.1 EASZY试验的框架与主要步骤示意图如图C.1所示。
图C.1 EASZY 试验的框架与主要步骤示意图
C.2 使用助溶剂时,试验溶液的详细制备流程如图C.2所示。受试物贮备液(DMSO)储存于-20 ℃
条件下,根据设置的浓度用DMSO 稀释成不同浓度的稀释液。加入1.5μL稀释液至15mL试验用水
中,将每个管都充分摇匀。将试验溶液转移至暴露容器中。每个试验浓度设置3个平行(R1、R2、
R3),每个平行加入15mL溶液,并放入7个胚胎。每次试验都设置空白对照、溶剂对照和阳性对照
(14.8ng/LEE2)。
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图C.2 使用助溶剂时,试验溶液的详细制备流程图
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GB/T45221—2025
附 录 D
(资料性)
EASZY 试验成像分析
图D.1为96h暴露后载有转基因斑马鱼的荧光载玻片的俯视图和侧视图。
a) 荧光载玻片俯视图 b) 荧光载玻片侧视图 c) 斑马鱼胚胎俯视图
图D.1 96h暴露后载有转基因斑马鱼的荧光载玻片的俯视图和侧视图
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附 录 E
(资料性)
96h后转基因斑马鱼体内荧光成像
E.1 图E.1为背侧视图(位于顶部上方),箭头指向沿心室的放射状胶质细胞,图E.1中很容易在不同
脑区观察到GFP。可采用不同的“曝光时间”来拍摄荧光图像,但不能将其用于GFP的定量以及比较
不同个体之间的GFP强度差异。
标引符号说明:
e ———眼;
m ———嘴;
RGCs———放射状胶质细胞;
Tel ———端脑;
Poa ———视前区;
hyp ———下丘脑。
注:从左到右为低水平至高水平。
图E.1 不同GFP表达水平的存活转基因tg(cyp19a1b:GFP )斑马鱼的体内荧光成像图
E.2 使用相同的参数拍摄图像以进行荧光分析。在图E.2示例中,与溶剂对照组相比,经EE2暴露的
胚胎的诱导倍数为25。
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标引符号说明:
Tel———端脑;
Poa———前视区;
LH———下丘脑下叶的背侧视图(位于顶部上方)。
图E.2 暴露于溶剂DMSO 和14.8ng/LEE2中的转基因tg(cyp19a1b:GFP )斑马鱼胚胎的体内成像图
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附 录 F
(资料性)
转基因斑马鱼的体内成像:广角荧光显微镜
F.1 通过配备10×物镜、GFP滤光镜、外部光源和荧光相机的荧光显微镜来实现荧光成像,可使用直
立式或倒置式显微镜。
F.2 设置荧光采集的参数至关重要,这取决于每个显微镜的主要技术特性。在所有试验中统一应用相
关参数。
a) 物镜:10×物镜可拍摄胚胎头部(定义为感兴趣区或ROI),从而避免拍摄与GFP相似波长荧
光的卵黄囊。宜使用特定物镜进行荧光分析(如Fluar)。
b) GFP滤波器:激发波长470nm(波段450nm~490nm);发射波长525nm(波段505nm~
545nm);激发和发射波长的波段均较低,且激发和发射光谱之间没有重叠。
c) 外部光源:可使用各种光源,光源通常由一个汞灯组成的;确保汞灯处于使用有效期内(不超过
500h),强度恒定。外部光源的稳定性可通过测定一系列的荧光滤光片进行评估。
d) 荧光相机:具有高分辨率和高灵敏度的电荷耦合设备(CCD)传感器;建议使用单色(黑白)数
码相机,与彩色相机相比,黑白相机可提高灵敏度,减少曝光时间。
e) 曝光时间:优化每台显微镜的曝光时间,以获得最佳的信噪比。
F.3 设置参数时,可改变相关设置以评估其对未暴露和暴露后的胚胎所发出荧光的影响。为此,宜开
展至少包含两个组别的试验:一个试验用水对照和一个阳性对照(14.8ng/LEE2)。试验结束时,在不
同的曝光时间下对每条鱼进行拍照(如在50ms~300ms范围内,采用规律间隔),然后分析图像,以确
定最佳曝光时间。合适的参数设置同时满足对照组和试验组试验鱼的荧光检测。如果曝光时间太
短,则无法正确检测到基础荧光。相反,如果曝光时间太长,易使高GFP表达水平的胚胎信号饱和。最
佳的曝光时间能产生最佳的信噪比。
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GB/T45221—2025
附 录 G
(资料性)
转基因斑马鱼的体内成像:ImageJ中图像分析宏的使用示例
G.1 EASZY_FAST宏
在EASZY试验中,通过荧光显微镜拍摄的图像,对鱼胚胎发出的荧光进行定量(见附录F)。图像
分析工作可完全自动化,以实现在短时间内的大量图像分析。图像分析通过一个免费的专门为
EASZY试验开发的EASZY_FAST宏进行,EASZY_FAST宏下载网址:https://imagej.net/FAST。
在图像分析步骤中存在一个参数,对应一个能将胚胎自体荧光与报告基因荧光区分开的阈值,即灰
度阈值。在对试验鱼体内的GFP进行定量之前,确定该参数。
G.2 确定灰度阈值
灰度阈值是图像分析的关键指标,对应一个能将报告荧光蛋白产生的荧光与鱼体自体荧光(背景荧
光)区分开的灰度值。为了确定灰度阈值,需建立以下程序。
a) 选择非转基因斑马鱼,采用之前定义的相同参数进行拍照(见图G.1)。
b) 将照片导入图像分析软件。
c) 手动定义一个感兴趣区(ROI),在转基因tg(cyp19a1b :GFP )斑马鱼中ROI通常指能观察到
GFP表达的脑区(见附录F)。
d) 对每个ROI进行分析,以获得所选区域内每个像素的灰度。
e) 灰度阈值指非转基因鱼的ROI中的最大灰度。为了获得精确的阈值,宜测定多条非转基
因鱼。
图G.1 用于测定背景荧光(灰度阈值)的非转基因斑马鱼胚胎的荧光成像图
灰度阈值一旦确定,将只分析灰度高于阈值的像素。每台荧光显微镜的灰度阈值都不相同,因为灰
度与拍摄用的相机和图像的分辨率(例如8比特/像素、12比特/像素、16比特/像素)密切相关。灰度阈
值不随时间改变,但当荧光设备发生变化时(如安装一个新的光源),灰度阈值可能会随之改变。
G.3 ImageJEASZY_FAST宏的操作概述
G.3.1 最低系统配置要求
使用EASZY_FAST宏所需的软件包括。
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GB/T45221—2025
a) ImageJ1.53或更高版本:https://imagej.net/Download或https://imagej.net/Fiji。
b) Java8或更高版本:www.java.com。
c) Bio-Formats6.6.1或更高版本:http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/(用于读写生
命科学图像文件格式的库)。
d) FASTAnalyze.ijm 文件保存到ImageJ中的Plugins目录:https://imagej.net/FASTseedetailsforautomaticinstallation
。
更多有关操作系统的说明可参见上述网址链接中的信息。
G.3.2 EASZY_FAST宏的图像分析处理流程
ImageJ宏可自动化处理一些任务(打开、设置阈值、保存、测定),从而能够处理大量图片,图像分析
处理流程见图G.2。ImageJ宏的具体操作步骤如下。
a) 步骤1,批处理所选目录:
———在选定的目录和子目录中列出所有用户定义的扩展名的文件(.czi、.zvi、.tif、.nd2);
———应用用户定义的阈值(默认值为290),分析该阈值以上的图像颗粒;
———将高于阈值的像素分组为一个ROI,并将该ROI保存在image目录中的压缩文件中。
b) 步骤2,查看选定的ROI并进行测定:
———逐个打开图像,查看自动选择的ROI;
———用户可确认ROI,也可直接修改或删除图像。
图G.2 图像分析处理流程图
G.3.3 图像分析处理的详细步骤
G.3.3.1 运行软件
运行ImageJ.exe,运行界面示意图见图G.3。启动ImageJ工具栏中的宏,打开插件(Plugins)\快速
(Fast)\快速分析(FAST_Analyze)。宏会提示选择包含图像文件的目录,所选目录和所有子目录将被
进行分析处理。
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GB/T45221—2025
图G.3 ImageJ运行界面示意图
G.3.3.2 参数设置
该宏将显示一个对话框,以设置分析选项(见图G.4)。
a) 阈值(Thresholdvalue):为像素强度设置较低的阈值,将图像分为ROI(高于阈值)和背景。
b) 采集系统(Acquisitionsystem):包括显微镜、相机、曝光时间,每个采集系统均设置阈值。
c) 文件类型(Filetype):在.czi、.zvi(蔡司)、.nd2(尼康)或.tif(标签图像文件格式)之中选择图像
类型。
d) 创建ROI(CreateROIs):步骤1,分析高于用户定义阈值的像素,并自动在image目录中将
ROIs(图片)保存为.zip文件。
e) 测定ROI(MeasureROIs):步骤2,逐一检查并测定步骤1中创建的ROI。对于步骤1中未被
选中的和步骤2中已被检查的ROI,可重新分析。
f) 覆盖已有的ROI(OverwriteexistingROIs):如果使用该选项,宏将在未经多次提示的情况
下,直接覆盖已有的ROI压缩文件。
g) 沉默模式(SilentMode):如果使用该选项,宏将在未经多次提示的情况下,测定所有图像及其
相关的ROI,这有利于重新分析以前的数据。
h) 重启模式(RestartMode):当自动处理被意外取消时,此模式将用于检查是否创建了ROI,并
在需要时自动创建一个ROI。
图G.4 参数设置界面示意图
G.3.3.3 ROI区域的选择和处理
在完成图像处理的步骤1(G.3.3.2)后,用户可查看图像及其相对应的ROI(见图G.5)。
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GB/T45221—2025
图G.5 ROI图像界面示意图
之后将弹出一个对话框(ROIcheck)来验证ROI(见图G.6)。如果ROI正确,用户应点击OK,并
继续查看下一个图像。用户可通过对话框从分析中删除当前图像(如模糊图像)或手动重新选择
ROI区域。只需在单选选项中选择Yes,然后选择OK或敲击键盘上Enter键。
图G.6 ROIcheck界面示意图
如果手动重新选择ROI区域,则会弹出一个新的对话框,用于访问ImageJ工具栏并修改黄色选择
区域,然后自动应用用户定义的阈值。如果要去除非特异性荧光(如卵黄),则需要使用手动工具,并按
住Alt键从ROI中删除选定区域。如果要在ROI区域中增加区域,则需要按住Shift键,并选择需要加
入到ROI中的新区域。点击OK 键验证新的ROI,然后测定图像并自动更新zip文件。完成步骤2
后,将自动在ImageJ的ResultTable窗口中列出所有已测定图像的文件名(见图G.7)。该表可自动保
存为启动时选择的工作目录中的csv或xls文件。
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图G.7 已测图像列表界面示意图
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附 录 H
(资料性)
数据报告和分析
H.1 由比对试验获得的溶剂、试验用水和阳性对照中GFP测定值的变异性
在4个实验室独立进行的EASZY 试验中对照组的GFP结果(以相对于溶剂对照的诱导倍数表
示)见表H.1。每个实验室均报告了溶剂对照、空白对照和与阳性对照(14.8ng/LEE2)组中的GFP测
定值(以相对溶剂对照的诱导倍数表示)及其标准偏差(SD),变异系数以CV%表示。这些数据表明了
各对照组中GFP测定的变异性在实验室间以及试验间是一致的。溶剂对照和空白对照中的变异系数
(CV%)较高,可能反映了斑马鱼发育过程中脑芳香化酶基因表达的变异性,以及通过荧光成像测定体
内GFP表达量的方法的变异性。尽管如此,EASZY试验的统计能力足以较好地测定对照组和试验组
之间的差异。
表H.1 在不同实验室中GFP测定的变异性
对照组分析指标
实验室A 实验室B 实验室C 实验室D
试验1 试验2 试验3 试验1 试验2 试验3 试验1 试验2 试验3 试验1 试验2 试验3
溶剂
对照
平均值1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
SD 0.4 0.6 0.5 0.6 0.5 0.6 0.7 0.7 0.7 0.4 0.5 0.6
CV/% 42.6 58.2 45.8 64.7 48.5 60.0 67.1 66.9 73.9 44.1 45.2 64.4
空白
对照
平均值1.0 0.8 0.9 1.4 1.4 0.9 1.0 1.4 1.3 0.9 1.0 1.2
SD 0.5 0.5 0.6 1.2 0.9 0.7 0.7 0.9 1.1 0.3 0.6 0.6
CV/% 55.1 60.2 68.8 89.7 65.7 74.3 69.2 61.1 83.6 33.7 59.8 46.4
阳性
对照
平均值17.2 24.1 20.5 13.9 9.4 9.6 29.4 15.0 22.3 10.3 9.9 17.0
SD 4.9 8.4 7.7 2.1 2.2 3.2 9.4 4.2 7.8 4.0 2.9 4.7
CV/% 28.3 35.0 37.4 15.1 23.6 33.0 31.8 27.8 35.0 38.7 29.2 27.5
H.2 EASZY 试验的典型数据案例
本示例中,物质A 以5个不同浓度(从最低浓度的C1到最高的C5)进行试验。设置3个不同的对
照组:溶剂对照、空白(重组水)对照和阳性对照(14.8ng/LEE2)。每个试验组均报告存活率、孵化率和
进行荧光图像分析的胚胎数量。GFP诱导倍数、存活率和孵化率的计算分别按公式(H.1)、公式(H.2)
和公式(H.3)计算,数据详见表H.2。
fGFP =e
m …………………………(H.1)
式中:
fGFP———荧光蛋白诱导倍数;
e ———胚胎中测量的荧光强度;
m ———对照组的平均荧光强度。
S =l
t ×100 …………………………(H.2)
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GB/T45221—2025
式中:
S ———胚胎存活率;
l ———受精96h后的活胚胎数;
t ———受精96h后的胚胎总数。
H =h
l ×100 …………………………(H.3)
式中:
H ———胚胎孵化率;
h ———受精96h后孵化的胚胎数;
l ———受精96h后的活胚胎数。
在本示例中,试验的有效性为:
a) 对照组存活率和孵化率符合有效性要求;
b) 阳性对照中GFP诱导的平均值大于9;
c) 试验组的死亡率符合规定的要求,且对所有试验组进行了受试物浓度分析。
表H.2 EASZY 试验数据示例
试验
组别
平
行
个
体
组别编号
胚胎荧光
强度
(RawIntDen)
GFP
(倍数)
平均
GFP
(倍数)
SD 平行
数
存活
率/%
孵化
率/%
平均
RawIntDen
平均
GFP
(倍数)
SD
溶剂
对照
1
1 DMSO_R1 4874116 0.8
2 DMSO_R1 6654906 1.1
3 DMSO_R1 622207 0.1
4 DMSO_R1 4076376 0.7
5 DMSO_R1 6779792 1.1
6 DMSO_R1 3912076 0.7
7 DMSO_R1 4281717 0.7
0.74 0.34 7 100 100
2
1 DMSO_R2 11635508 1.9
2 DMSO_R2 9900998 1.7
3 DMSO_R2 4210012 0.7
4 DMSO_R2 5674354 0.9
5 DMSO_R2 5865124 1.0
6 DMSO_R2 6687435 1.1
1.27 0.51 6 86 100
3
1 DMSO_R3 4940098 0.8
2 DMSO_R3 6396897 1.1
3 DMSO_R3 7158886 1.2
4 DMSO_R3 7239720 1.2
5 DMSO_R3 8961822 1.5
6 DMSO_R3 3762552 0.6
1.07 0.31 6 86 100
5980768 1.00 0.41
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表H.2 EASZY 试验数据示例(续)
试验
组别
平
行
个
体
组别编号
胚胎荧光
强度
(RawIntDen)
GFP
(倍数)
平均
GFP
(倍数)
SD 平行
数
存活
率/%
孵化
率/%
平均
RawIntDen
平均
GFP
(倍数)
SD
空白
对照
(重组
水)
1
1 ISO_Water_R1 2666553 0.4
2 ISO_Water_R1 6351281 1.1
3 ISO_Water_R1 9904374 1.7
4 ISO_Water_R1 7550167 1.3
5 ISO_Water_R1 6793603 1.1
6 ISO_Water_R1 9486469 1.6
7 ISO_Water_R1 9148253 1.5
1.24 0.42 7 100 100
2
1 ISO_Water_R2 5156341 0.9
2 ISO_Water_R2 10897349 1.8
3 ISO_Water_R2 7533429 1.3
4 ISO_Water_R2 5025053 0.8
5 ISO_Water_R2 4776223 0.8
6 ISO_Water_R2 3997141 0.7
7 ISO_Water_R2 11819339 2.0
1.18 0.53 7 100 100
3
1 ISO_Water_R3 5842230 1.0
2 ISO_Water_R3 9431310 1.6
3 ISO_Water_R3 5757365 1.0
4 ISO_Water_R3 7308139 1.2
5 ISO_Water_R3 7338579 1.2
6 ISO_Water_R3 2945410 0.5
1.08 0.36 6 86 100
6986430 1.17 0.42
阳性
对照
(EE2
14.8
ng/L)
1
1 EE2_R1 71930735 12.0
2 EE2_R1 105122998 17.6
3 EE2_R1 53386070 8.9
4 EE2_R1 64083240 10.7
5 EE2_R1 60552970 10.1
6 EE2_R1 68295748 11.4
7 EE2_R1 66149186 11.1
11.69 2.78 7 100 100
2
1 EE2_R2 102759393 17.2
2 EE2_R2 58198318 9.7
3 EE2_R2 124051865 20.7
4 EE2_R2 58021914 9.7
5 EE2_R2 120673117 20.2
14.24 4.98 7 100 100
8427197514.094.68
26
GB/T45221—2025
表H.2 EASZY 试验数据示例(续)
试验
组别
平
行
个
体
组别编号
胚胎荧光
强度
(RawIntDen)
GFP
(倍数)
平均
GFP
(倍数)
SD 平行
数
存活
率/%
孵化
率/%
平均
RawIntDen
平均
GFP
(倍数)
SD
阳性
对照
(EE2
14.8
ng/L)
2 6 EE2_R2 72252446 12.1
7 EE2_R2 60313370 10.1 14.24 4.98 7 100 100
3
1 EE2_R3 112369410 18.8
2 EE2_R3 77830991 13.0
3 EE2_R3 139233203 23.3
4 EE2_R3 137034544 22.9
5 EE2_R3 64271974 10.7
6 EE2_R3 71380413 11.9
7 EE2_R3 81799575 13.7
16.34 5.26 7 100 100
8427197514.094.68
物质A
(C1)
1
1 subtance_C1_R1 13507593 2.3
2 subtance_C1_R1 11836562 2.0
3 subtance_C1_R1 14976217 2.5
4 subtance_C1_R1 10908321 1.8
5 subtance_C1_R1 10010384 1.7
6 subtance_C1_R1 10036746 1.7
7 subtance_C1_R1 7756360 1.3
1.89 0.40 7 100 100
2
1 subtance_C1_R2 16527601 2.8
2 subtance_C1_R2 6310398 1.1
3 subtance_C1_R2 9783991 1.6
4 subtance_C1_R2 14343054 2.4
5 subtance_C1_R2 17064048 2.9
6 subtance_C1_R2 5417556 0.9
7 subtance_C1_R2 14930672 2.5
2.02 0.81 7 100 100
3
1 subtance_C1_R3 5615174 0.9
2 subtance_C1_R3 10448075 1.7
3 subtance_C1_R3 8869381 1.5
4 subtance_C1_R3 14725626 2.5
5 subtance_C1_R3 14252784 2.4
6 subtance_C1_R3 5568572 0.9
7 subtance_C1_R3 4263219 0.7
1.52 0.71 7 100 100
10816778 1.81 0.66
27
GB/T45221—2025
表H.2 EASZY 试验数据示例(续)
试验
组别
平
行
个
体
组别编号
胚胎荧光
强度
(RawIntDen)
GFP
(倍数)
平均
GFP
(倍数)
SD 平行
数
存活
率/%
孵化
率/%
平均
RawIntDen
平均
GFP
(倍数)
SD
物质A
(C2)
1
1 subtance_C2_R1 6775729 1.1
2 subtance_C2_R1 12434825 2.1
3 subtance_C2_R1 4407107 0.7
4 subtance_C2_R1 12624433 2.1
5 subtance_C2_R1 9470396 1.6
6 subtance_C2_R1 7305193 1.2
7 subtance_C2_R1 5678952 0.9
1.40 0.54 7 100 100
2
1 subtance_C2_R2 4496991 0.8
2 subtance_C2_R2 6987774 1.2
3 subtance_C2_R2 7257037 1.2
4 subtance_C2_R2 5504582 0.9
5 subtance_C2_R2 7767892 1.3
6 subtance_C2_R2 12667120 2.1
7 subtance_C2_R2 10757400 1.8
1.32 0.48 7 100 100
3
1 subtance_C2_R3 9308406 1.6
2 subtance_C2_R3 12899089 2.2
3 subtance_C2_R3 9951068 1.7
4 subtance_C2_R3 8467905 1.4
5 subtance_C2_R3 4795936 0.8
6 subtance_C2_R3 7996179 1.3
7 subtance_C2_R3 10093706 1.7
1.52 0.41 7 100 100
8459415 1.41 0.46
物质A
(C3)
1
1 subtance_C3_R1 14600703 2.4
2 subtance_C3_R1 10101759 1.7
3 subtance_C3_R1 7281076 1.2
4 subtance_C3_R1 8902999 1.5
5 subtance_C3_R1 15269349 2.6
6 subtance_C3_R1 10509714 1.8
7 subtance_C3_R1 10398688 1.7
1.84 0.49 7 100 100
2
1 subtance_C3_R2 14534037 2.4
2 subtance_C3_R2 11519299 1.9
3 subtance_C3_R2 8960455 1.5
4 subtance_C3_R2 11719652 2.0
2.14 0.41 6 86 100
12292910 2.06 0.55
28
GB/T45221—2025
表H.2 EASZY 试验数据示例(续)
试验
组别
平
行
个
体
组别编号
胚胎荧光
强度
(RawIntDen)
GFP
(倍数)
平均
GFP
(倍数)
SD 平行
数
存活
率/%
孵化
率/%
平均
RawIntDen
平均
GFP
(倍数)
SD
物质A
(C3)
2 5 subtance_C3_R2 14867058 2.5
6 subtance_C3_R2 15082903 2.5 2.14 0.41 6 86 100
3
1 subtance_C3_R3 12646133 2.1
2 subtance_C3_R3 15363363 2.6
3 subtance_C3_R3 16852074 2.8
4 subtance_C3_R3 13450406 2.2
5 subtance_C3_R3 8519588 1.4
6 subtance_C3_R3 18274318 3.1
7 subtance_C3_R3 7004622 1.2
2.20 0.70 7 100 100
12292910 2.06 0.55
物质A
(C4)
1
1 subtance_C4_R1 38287375 6.4
2 subtance_C4_R1 24544667 4.1
3 subtance_C4_R1 29107967 4.9
4 subtance_C4_R1 36096743 6.0
5 subtance_C4_R1 23646007 4.0
6 subtance_C4_R1 22236473 3.7
7 subtance_C4_R1 48271083 8.1
5.31 1.60 7 100 100
2
1 subtance_C4_R2 18592109 3.1
2 subtance_C4_R2 25768398 4.3
3 subtance_C4_R2 13015362 2.2
4 subtance_C4_R2 32592848 5.4
5 subtance_C4_R2 19489317 3.3
6 subtance_C4_R2 22684485 3.8
7 subtance_C4_R2 26854149 4.5
3.80 1.07 7 100 100
3
1 subtance_C4_R3 12260474 2.0
2 subtance_C4_R3 23377756 3.9
3 subtance_C4_R3 19131382 3.2
4 subtance_C4_R3 39511233 6.6
5 subtance_C4_R3 25386701 4.2
6 subtance_C4_R3 15465375 2.6
7 subtance_C4_R3 18306430 3.1
3.67 1.49 7 100 100
25458397 4.26 1.54
物质A
(C5) 1 1 subtance_C5_R1 130323975 21.8
2 subtance_C5_R1 111652396 18.7 17.59 3.71 7 100 100 2545839719.004.59
29
GB/T45221—2025
表H.2 EASZY 试验数据示例(续)
试验
组别
平
行
个
体
组别编号
胚胎荧光
强度
(RawIntDen)
GFP
(倍数)
平均
GFP
(倍数)
SD 平行
数
存活
率/%
孵化
率/%
平均
RawIntDen
平均
GFP
(倍数)
SD
物质A
(C5)
1
3 subtance_C5_R1 117792473 19.7
4 subtance_C5_R1 112146114 18.8
5 subtance_C5_R1 82246955 13.8
6 subtance_C5_R1 67096120 11.2
7 subtance_C5_R1 114946079 19.2
17.59 3.71 7 100 100
2
2 subtance_C5_R2 108883032 18.2
3 subtance_C5_R2 144832092 24.2
4 subtance_C5_R2 131283589 22.0
5 subtance_C5_R2 54632538 9.1
6 subtance_C5_R2 139580958 23.3
19.37 6.16 5 86 100
3
1 subtance_C5_R3 159768777 26.7
2 subtance_C5_R3 104079657 17.4
3 subtance_C5_R3 125300941 21.0
4 subtance_C5_R3 92586729 15.5
5 subtance_C5_R3 103730320 17.3
6 subtance_C5_R3 144902198 24.2
20.35 4.41 6 86 100
2545839719.004.59
注:胚胎荧光强度基于图像分析,见附录G。
H.3 作图分析
采用适当的统计方法来比较试验组和对照组之间的响应,以确定某种化学物质的潜在活性。
图H.1为物质A 的浓度-反应图。该示例中,可得到受试物产生显著诱导效应的最低浓度(0.33mg/L)
和产生最大诱导倍数的浓度(1.00mg/L)。
注:****(p=0.0001)和**(p=0.0042)表示与对照组相比具有显著性差异。
图H.1 物质A 的浓度-反应图
30
GB/T45221—2025
附 录 I
(资料性)
数据统计分析的流程图
数据统计分析的流程图如图I.1所示。
图I.1 数据统计分析的流程图
31
GB/T45221—2025
附 录 J
(资料性)
EASZY 试验中的浓度-反应关系示例
J.1 受试物1
受试物1的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) GFP表达与受试物浓度存在相关性,与溶剂对照相比具有显著差异,诱导倍数大于2;
d) 判定该受试物为阳性物质;
e) 示例见图J.1。
图J.1 受试物1的浓度-反应示例图
J.2 受试物2
受试物2的浓度-反应结果分析如下。
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异。
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9。
c) GFP与受试物浓度存在相关性,与溶剂对照相比具有显著差异,GFP的平均诱导倍数大于2。
d) 判定该受试物为阳性物质。
e) 最高浓度组(C5)的诱导倍数低于C3和C4浓度组,表明受试物可能具有亚毒性作用。如果试
验目的是通过推导EC50来量化雌激素活性,则排除该浓度。需仔细研究最高浓度组的胚胎存
活率和孵化率。
f) 示例见图J.2。
32
GB/T45221—2025
图J.2 受试物2的浓度-反应示例图
J.3 受试物3
受试物3的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) 所有试验浓度均有显著差异,且GFP平均诱导倍数大于2;
d) 该受试物在EASZY试验中具有活性;
e) 示例见图J.3。
图J.3 受试物3的浓度-反应示例图
J.4 受试物4
受试物4的浓度-反应结果分析如下:
a) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
b) 在受试物的最高浓度组中,GFP的诱导效应显著;
c) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达有显著差异;
d) 该受试物在EASZY试验中具有活性;
e) 当观察到溶剂效应时,宜使用新的溶剂重新开展试验;
f) 示例见图J.4。
33
GB/T45221—2025
图J.4 受试物4的浓度-反应示例图
J.5 受试物5
受试物5的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) 试验组与溶剂对照相比无显著差异,且GFP诱导倍数小于2;
d) 判定该受试物为阴性物质;
e) 示例见图J.5。
图J.5 受试物5的浓度-反应示例图
J.6 受试物6
受试物6的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) 与溶剂对照相比,受试物的C4和C5浓度组存在显著的GFP抑制作用;
d) 该受试物在EASZY试验中无活性;
e) 示例见图J.6。
34
GB/T45221—2025
图J.6 受试物6的浓度-反应示例图
J.7 受试物7
受试物7的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) C3浓度组的GFP表达存在显著差异且GFP平均诱导倍数大于2;
d) 无法得出正式的结论;
e) 由于浓度-反应关系为非典型,重复试验;
f) 检查两个最高浓度试验组的孵化率和(或)死亡率数据,分析这两个浓度组GFP诱导降低的
原因;
g) 示例见图J.7。
图J.7 受试物7的浓度-反应示例图
J.8 受试物8
受试物8的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) 最低浓度组的GFP表达存在显著差异且GFP平均诱导倍数大于2;
d) 由于浓度-反应关系为非典型,在新的浓度范围内(包括低于C1的浓度)重复试验;
e) 示例见图J.8。
35
GB/T45221—2025
图J.8 受试物8的浓度-反应示例图
J.9 受试物9
受试物9的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 受试物对GFP的诱导表现出浓度依赖,且GFP平均诱导倍数大于2;
c) 阳性对照的GFP平均诱导倍数小于9,由于阳性对照不符合有效性标准,重复试验;
d) 此时高度怀疑受试物具有活性,但仍需获得有效的试验结果进行验证;
e) 示例见图J.9。
图J.9 受试物9的浓度-反应示例图
J.10 受试物10
受试物10的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) 最高浓度组的GFP表达存在显著差异;
d) 但在最高浓度组中,GFP平均诱导倍数不大于2;
e) 宜在考虑溶解度和胚胎最大耐受浓度的情况下,设置比C5更高的浓度重新进行试验;
f) 如果在第二次试验中获得类似的结果,则不能确定该受试物在EASZY试验中具有活性;
g) 可开展其他相关试验予以验证;
h) 示例见图J.10。
36
GB/T45221—2025
图J.10 受试物10的浓度-反应示例图
J.11 受试物11
受试物11的浓度-反应结果分析如下:
a) GFP在试验用水和溶剂对照中的表达无显著差异;
b) 阳性对照的GFP平均诱导倍数不小于9;
c) 最高浓度组的GFP平均诱导倍数大于2;
d) 但与溶剂对照相比,诱导作用不显著,重复试验;
e) 如果获得类似的数据,则不能仅根据EASZY试验结果得出明确结论;
f) 示例见图J.11。
图J.11 受试物11的浓度-反应示例图
37
GB/T45221—2025
参 考 文 献
[1] OECDNo.236 FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test.OECDGuidelinesforthetesting
ofchemicals.Paris:OECD,2013.
[2] OECD No.250 EASZYassay:DetectionofEndocrineActiveSubstances,actingthrough
estrogenreceptors,usingtransgenictg (cyp19a1b :GFP )Zebrafishembryos,OECDGuidelinesforthe
testingofchemicals.Paris:OECD,2021.
38
GB/T45221—2025
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