GB/T 27621-2024 马鼻肺炎诊断技术

ICS11.220
CCS B41
中华人民共和国国家标准
GB/T27621—2024
代替GB/T27621—2011
马鼻肺炎诊断技术
Diagnostictechniquesforequinerhinopneumonitis
2024-11-28发布2025-06-01实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发布

目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
引言………………………………………………………………………………………………………… Ⅳ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 缩略语…………………………………………………………………………………………………… 1
5 临床诊断………………………………………………………………………………………………… 2
6 样品采集、处理与保存…………………………………………………………………………………… 2
7 实时荧光PCR…………………………………………………………………………………………… 4
8 病毒分离鉴定…………………………………………………………………………………………… 5
9 微量血清中和试验……………………………………………………………………………………… 7
10 EHV-1/4通用抗体间接ELISA ……………………………………………………………………… 9
11 EHV-1/4分型鉴别间接ELISA …………………………………………………………………… 10
12 综合判定……………………………………………………………………………………………… 12
附录A (规范性) 试剂配制方法………………………………………………………………………… 13
附录B(资料性) 核酸检测用引物、探针序列信息…………………………………………………… 14
Ⅰ
GB/T27621—2024

前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本 文件代替GB/T27621—2011《马鼻肺炎病毒PCR 检测方法》,与GB/T27621—2011相比,除
结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
———删除了EHV 的PCR检测(见2011年版的第7章);
———增加了临床诊断(见第5章);
———增加了样品采集、处理与保存(见第6章);
———增加了实时荧光PCR(见第7章);
———更改了病毒分离鉴定(见第8章,2011年版的第6章);
———增加了微量血清中和试验(见第9章);
———增加了EHV-1/4通用抗体间接ELISA(见第10章);
———增加了EHV-1/4分型鉴别间接ELISA(见第11章)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。
本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、青岛海关技术中心、新疆农业大学、
江苏农牧科技职业学院、广州海关技术中心。
本文件主要起草人:王艳、朱来华、刘建华、郑小龙、李健、胡月、武彩红、冯之航、薛俊欣、蔡一村、
林颖峥、张强、王群、吴晓薇。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
———2011年首次发布为GB/T27621—2011;
———本次为第一次修订。
Ⅲ
GB/T27621—2024
引 言
根据世界动物卫生组织(WOAH)中《陆生动物诊断试验和疫苗手册》定义,马鼻肺炎(Equinerhinopneumonitis,
ER)是由亲缘关系密切的马甲疱疹病毒1型(Equidalphaherpesvirus-1,EHV-1)和马甲
疱疹病毒4型(Equidalphaherpesvirus-4,EHV-4)引起的马属动物的几种高度传染性疫病的总称,在世
界马群中呈地方性流行。EHV-1感染被列入WOAH 名录。
马甲疱疹病毒1型和马甲疱疹病毒4型隶属于疱疹病毒科α亚科疱疹病毒水痘病毒属。病毒呈球
形或不规则球形,直径为120nm~200nm,内含20面体核衣壳。
EHV-1感染马主要症状为上呼吸道感染、流产、新生驹死亡和神经症状;EHV-4只感染马,引起发
热、嗜睡、厌食、下颌淋巴结病变和大量浆液性、黏液脓性鼻腔分泌物等呼吸道症状。
马鼻肺炎诊断技术包括临床诊断、病原学检测和血清学检测方法。
本文件的修订参考了《陆生动物诊断试验与疫苗手册》(WOAH)的有关内容,并结合了我国相关技
术研究新成果。
Ⅳ
GB/T27621—2024
马鼻肺炎诊断技术
1 范围
本文件描述了EHV-1感染和EHV-4感染的临床诊断、样品采集与处理,以及实时荧光PCR、病毒
分离鉴定、微量血清中和试验、间接ELISA 的方法。
本文件适用于EHV-1感染和EHV-4感染的诊断、监测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHK-21:乳仓鼠肾细胞(BabyHamsterKidney-21)
CPE:细胞病变反应(CytopathicEffect)
Ct值:循环阈值(CycleThreshold)
DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)
EDTA·Na2:乙二胺四乙酸二钠盐(EthyleneDiamineTeraaceticAcidDisodiumSalt)
E-derm:马真皮成纤维细胞系(Equine-dermisCell)
EHV-1:马疱疹病毒-1型(EquineHerpesvirus-1)
EHV-4:马疱疹病毒-4型(EquineHerpesvirus-4)
ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay)
MDBK:牛肾细胞(BovineKidneyCell)
MEM:最低需要培养基(MinimumEssentialMedium)
OD值:光密度值(OpticalDensity)
PBS:磷酸盐缓冲生理盐水(PhosphateBufferSaline)
PCR:聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)
RK-13:兔肾细胞系(RabbitKidneyCell)
TCID50:半数组织感染量(MedianTissueCultureInfectiveDose)
TE:TE缓冲液(Tris-EDTA)
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5 临床诊断
5.1 流行病学
5.1.1 马属动物是EHV-1和EHV-4的自然宿主。各种年龄的马均可感染,常发生于青年马匹,2岁以
下幼驹发病最多。
5.1.2 病马和恢复后的带毒马是本病的主要传染源。病毒存在于病马的鼻液、血液和粪便,以及流产
马的胎膜、胎液和胎儿组织内。
5.1.3 EHV-1存在于病马流产时的排出物中,通过直接接触(包括交配)和间接接触传播,可经子宫感
染胎儿;EHV-4存在于病马的鼻腔分泌物中,常经呼吸道和消化道传播。
5.2 临床症状
5.2.1 EHV-1和EHV-4可引起呼吸系统原发性感染,导致呼吸道疾病,主要表现为发热、食欲不振、
沉郁、流涕和呼吸困难。
5.2.2 EHV-1可引起流产,也有个别报道可从流产胎儿分离得到EHV-4。怀孕母马感染后突然发生
不明原因的流产,同时伴有发热、沉郁等症状,流产胎儿一般为死胎,产出为活胎的多在数日后死亡。
5.2.3 EHV-1感染还能引起神经症状。早期表现为突然共济失调、轻度瘫痪、尾部僵硬、尿失禁等,大
多伴有发热、流产、呼吸系统症状。
5.3 病理变化
5.3.1 在气管、胃和小肠中有胶冻样黏膜皱壁,小肠的孤立淋巴滤泡和集合淋巴结肿大,有些地方出现
浅表性烂斑或较深的溃疡。
5.3.2 早期流产的胎儿发生严重的自溶。后期流产的胎儿体表外观新鲜,皮下常有不同程度的水肿和
出血,可视黏膜黄染。心肌出血,肺水肿和胸、腹水增量,脾脏肿大。肝包膜下散在针尖大到粟粒大灰黄
色坏死灶。
5.3.3 表现血管炎、出血、血栓、缺血性神经元损伤等症状。
5.4 结果判定
出现上述流行病学特征、临床症状和病理变化的病例,可初步判定为疑似EHV-1感染或EHV-4
感染,应进一步进行实验室检测确诊。
6 样品采集、处理与保存
6.1 仪器设备
6.1.1 组织研磨器。
6.2 试剂材料
6.2.1 一次性采血管(含有抗凝剂)。
6.2.2 一次性采血管(不含有抗凝剂)。
6.2.3 一次性采血针。
6.2.4 一次性采样拭子(鼻咽拭子)。
6.2.5 MEM 培养基。
2
GB/T27621—2024
6.2.6 PBS,按照附录A 中A.1配制。
6.2.7 10mL采样管。
6.2.8 1.5mL离心管。
6.2.9 10mL注射器。
6.2.10 微孔滤膜器(0.45μm)。
6.2.11 抗生素储存液溶液,按照A.2配制。
6.2.12 组织研磨器。
6.2.13 淋巴细胞分离液(商品化试剂)。
6.3 样品采集
6.3.1 样品的采集
按NY/T541的要求执行。
6.3.2 鼻咽拭子
以无菌鼻咽采样拭子探入动物鼻咽进行采样(最好在呼吸道症状急性期采集),放入3mL 预冷
PBS或MEM 于灭菌的10mL采样管中。
6.3.3 组织样品
无菌采集流产病例的胎盘或胎儿的肝、肺、胸腺、脾等。有神经症状死亡的动物采集脑或脊髓等组
织样品或脑脊髓液。
6.3.4 抗凝全血
用一次性采血针采集血液10mL~20mL放入一次性采血管(含有抗凝剂);抗凝剂可以使用柠檬
酸盐、肝素或EDTA,EDTA 是PCR检测的首选抗凝剂。
6.3.5 血清
用一次性采血针采集血液3mL~5mL放入一次性采血管(不含抗凝剂)中。
6.4 样品保存
所有样本应置于4℃条件下,立即送往检测实验室,不能在24h内处理的样品应置于-20℃。若
需长期保存,应置于-70℃。
6.5 样品处理
6.5.1 核酸检测用样品
6.5.1.1 鼻咽拭子:鼻咽拭子浸出液可直接用于PCR检测或进行核酸提取后进行荧光PCR检测。
6.5.1.2 组织样品:取待检组织样品2.0g于组织研磨器中充分研磨,加10mLPBS混匀,在4 ℃下
3000r/min离心15min,取上清液转入无菌的1.5mL离心管中,编号,进行核酸提取后进行荧光PCR
检测。
6.5.1.3 全血样品:可直接提取核酸后进行荧光PCR检测,也可按照淋巴细胞分离液说明书提取外周
单核细胞后进行荧光PCR检测,待检。
6.5.2 病毒分离鉴定用样品
6.5.2.1 鼻咽拭子:将鼻咽拭子浸出液转移至无菌的10mL注射器,将液体从拭子挤入无菌试管,也可
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将浸出液通过灭菌的0.45μm 微孔滤膜器过滤入无菌试管,待检。
6.5.2.2 组织样品:将待检肝、肺、淋巴结等组织样品混合,在无菌条件下用灭菌的解剖剪将组织块剪碎
成约1mm3 小块,置于无菌平皿中。加入含1%抗生素储存液的无血清MEM 培养基,置于组织研磨器
中研磨,1000r/min离心10min,吸出上清,经无菌的0.45μm 微孔滤膜器过滤,取滤过液,保存、待检。
6.5.3 血清样品
自然凝固后无菌分离血清或2000r/min离心5min,取上清,待检。
7 实时荧光PCR
7.1 仪器与设备
7.1.1 荧光PCR仪。
7.1.2 高速台式离心机。
7.1.3 瞬时离心机。
7.1.4 混匀器。
7.1.5 冰箱(2℃~8℃、-20℃)
7.2 试剂与材料
7.2.1 DNA 提取试剂盒。
7.2.2 荧光PCR预混液(探针法)。
7.2.3 透明薄壁PCR管(0.2mL)或八联管。
7.2.4 引物和荧光探针:序列见附录B,加TE水配制成100μmol/L的储存液和10μmol/L工作液。
7.2.5 阳性对照:EHV-1或者EHV-4DNA 或者病毒分离培养物。
7.2.6 阴性对照:RK-13等正常细胞对照或马鼻肺炎阴性动物鼻拭子液。
7.2.7 微量移液器(10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL)。
7.2.8 吸头(1000μL、200μL、20μL、10μL)。
7.3 DNA 提取
7.3.1 待检样品使用6.5.1中处理的样品。
7.3.2 按商品化DNA 提取试剂盒的操作说明书,提取模板DNA,提取的DNA 应迅速进行PCR 扩
增,或置于-20℃冰箱保存。
7.4 实时荧光PCR 反应
7.4.1 反应体系
从试剂盒中取出相应的各种试剂,置于冰上融化,按照荧光PCR反应试剂配制反应体系,在样本处
理区加入模板DNA 样本。同时设置阴性对照和阳性对照。按表1配制相应反应体系。
表1 实时荧光PCR 反应体系
组分体积/μL
2×实时荧光PCR缓冲液10
上游引物0.8
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表1 实时荧光PCR 反应体系(续)
组分体积/μL
下游引物0.8
探针0.4
模板DNA 2
无核酸酶水6
总体积20
7.4.2 反应程序
振荡混匀后瞬时离心后,置荧光PCR 扩增仪内进行扩增。按下列程序进行反应:37 ℃污染消化
2min;95℃预变性10min;95℃变性15s,60℃退火60s,40个循环,在每一个循环的60℃收集荧光
信号。
注:反应体系、时间和温度随所用试剂盒的不同而适当改变。
7.4.3 结果判定
7.4.3.1 试验成立条件
阳性对照的Ct值应≤30,且出现典型的扩增曲线,阴性对照无Ct值或Ct值≥40且无典型扩增曲
线,则试验结果成立;否则,试验不成立。
7.4.3.2 判定指标
被检样本Ct值≤35,且出现典型的扩增曲线,判定为EHV-1或EHV-4核酸阳性;当无Ct值或Ct
值≥40,判为阴性;当35<ct值<40且出现典型的扩增曲线,判为疑似。对疑似样本,应重复检测,ct
值<40且出现典型的扩增曲线即判为核酸阳性;否则,判定为核酸阴性。
7.4.3.3 序列测定与比对
为了进一步验证检测结果,可用荧光PCR上下游引物进行扩增,并对产物进行序列测定,并与已公
开发表的EHV-1或EHV-4特异性片段序列进行同源性比对分析,以确证检测结果。
8 病毒分离鉴定
8.1 仪器与设备
8.1.1 CO2 细胞培养箱(37℃)。
8.1.2 冰箱(2℃~8℃、-20℃、-70℃)。
8.1.3 倒置显微镜。
8.1.4 生物安全柜。
8.1.5 恒温水浴锅(37℃)。
8.1.6 离心机。
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8.2 试剂与材料
8.2.1 胎牛血清。
8.2.2 MEM 培养基。
8.2.3 抗生素储存液溶液,按照A.2配制。
8.2.4 细胞染色液,按照A.3配制。
8.2.5 RK-13、BHK-21或MDBK。
8.2.6 马皮细胞或原代马胎儿肾细胞。
8.2.7 EHV-1型和EHV-4型标准毒株。
8.2.8 细胞培养瓶。
8.2.9 微量可调移液器(100μL、1000μL)。
8.2.10 胰酶。
8.2.11 细胞维持液,按照A.4配制。
8.3 试验程序
8.3.1 单层细胞的制备
EHV-4分离应使用马源细胞培养才能获得有效分离,EHV-1分离可使用多种细胞培养。用含
10%胎牛血清、1%抗生素储存液溶液的MEM 培养基复苏E-derm 等马源细胞和RK-13、BHK-21或
MDBK等非马源细胞。使用胰酶等消化细胞,使细胞终浓度为每毫升5×104 个细胞。将稀释后的细
胞加入96孔细胞培养板(100μL/孔),或取8mL~10mL接种至25mL细胞培养瓶中。5%(体积分
数)CO2 细胞培养箱中37℃培养至单层细胞。
8.3.2 样品接种
取6.5.2中的过滤液0.5mL接种到25cm2 细胞瓶中单层细胞上或取50μL至96孔培养板中单层
细胞上,5% (体积分数)CO2细胞培养箱中37℃孵育1h,移去上清液,细胞单层用PBS冲洗2次,加入
10mL维持液(25cm2 细胞瓶)或100μL(96孔培养板),置于5% (体积分数)CO2细胞培养箱中37℃
继续孵育。
8.3.3 对照设置
设置阴性对照和阳性对照。阴性对照,不接种样品,仅加入0.5mL维持液;阳性对照,接种0.5mL
的60倍稀释的标准病毒。
8.3.4 镜检观察
每天在倒置显微镜下观察细胞状态,记录观察结果。马甲疱疹病毒引起的CPE表现为细胞圆缩、
脱落、裂解。
8.3.5 盲传
培养物培养7d后,若无CPE,培养物冻融一次,取0.5mL在新的单层细胞上盲传一次。
8.3.6 细胞染色
培养物培养7d后,若无CPE,另可倒去培养液,加入细胞染色液,放置15min后,自来水冲洗。完
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GB/T27621—2024
整单层细胞染成蓝色,而被病毒感染破坏的细胞染色时形成不着色的空斑。
8.4 结果判定
8.4.1 试验成立条件
检查各种对照试验,阴性对照正常,无CPE或细胞染成蓝色;阳性对照出现明显的CPE或细胞不
着色,试验成立。
8.4.2 结果观察
被检样品出现明显的CPE,表现为细胞圆缩、脱落、裂解,或者细胞不着色,则判为病毒分离阳
性,作进一步的鉴定;被检样品没有明显的CPE,则判为阴性。
8.5 病毒鉴定
收集含有病毒的细胞悬液,按照第7章所列方法进行鉴定。
9 微量血清中和试验
9.1 仪器与设备
9.1.1 生物安全柜。
9.1.2 CO2 细胞培养箱(37℃)。
9.1.3 倒置显微镜。
9.1.4 冰箱(2℃~8℃、-20℃、-70℃)。
9.1.5 恒温水浴锅(37℃)。
9.2 试剂与材料
9.2.1 胎牛血清。
9.2.2 MEM 培养基。
9.2.3 胰酶。
9.2.4 抗生素储存液溶液,按照A.2配制。
9.2.5 细胞维持液,按照A.4配制。
9.2.6 细胞培养液,按照A.5配制。
9.2.7 RK-13或BHK-21或MDBK。
9.2.8 Ederm 或原代马胎儿肾细胞。
9.2.9 EHV-1型和EHV-4型标准毒株。
9.2.10 细胞培养瓶。
9.2.11 15mL离心管。
9.2.12 10mL注射器。
9.2.13 微量可调移液器(100μL、1000μL)。
9.2.14 微量细胞培养板(96孔)。
9.2.15 一次性移液管(1mL、10mL)。
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GB/T27621—2024
9.3 试验方法
9.3.1 血清样品的灭活
试验前将6.5.3中血清样品置于56℃水浴中灭活30min。
9.3.2 病毒滴度测定
9.3.2.1 中和病毒制备
将保持于液氮中的标准种毒株取出置于4 ℃缓慢融化,将融化的种毒用细胞维持液做60倍稀释
后,取1mL接种于长成单层RK-13(EHV-1)或E-derm(EHV-4)细胞的细胞瓶中,37 ℃吸附1h,然
后,先用维持液洗涤一次,再加入维持液,37℃培养36h~48h,当50%~75%细胞出现CPE,即可收获
病毒培养液,分装成1mL后-70℃冻存备用。
9.3.2.2 病毒滴度测定
9.3.2.2.1 滴度测定
在微量细胞培养板(96孔)每孔加100μL细胞培养液,用维持液将冻存病毒做10倍系列稀释,将
10-1、10-2…10-8稀释度病毒液分别取25μL加入细胞培养板,每个稀释度重复8孔。每孔100μL细
胞(5×105 个/mL),置37℃ CO2 细胞培养箱培养,48h后初判,96h终判。如细胞对照正常,接种病
毒的细胞出现CPE,记录试验数据。
9.3.2.2.2 计算病毒滴度
以K?rbe法计算该批病毒的滴度。
病毒滴度按公式(1)计算:
lgTCID50 =L -d(s-0.5) ……………………(1)
式中:
lgTCID50———半数组织感染量对数值;
L ———最高稀释度的对数;
d ———稀释度对数之间的差;
s ———阳性孔比率和。
9.3.3 中和试验
9.3.3.1 在96孔细胞培养板上每孔加40μL无血清的MEM。取每一被检血清40μL,加于A 行和
B行两重复孔内。第1排作为血清毒性对照,第2排是被检血清的第1次稀释。从B行开始向下做倍
比稀释,即混合后取40μL,加入下一孔,充分混合,同法依次稀释,直至最后一孔。同一血清加两孔做
平行试验,每板可测定6个血清样。
9.3.3.2 每孔加40μL适当稀释的EHV-1或EHV-4病毒(100TCID50/孔),A 排除外。血清的最终稀
释度在加入病毒后的起始稀释度为1∶4。
9.3.3.3 另取一对照板,应包括已知滴度的阴性血清对照和阳性血清对照、细胞对照、病毒对照。病毒
对照(病毒回归试验)用于计算使用中病毒精确用量的病毒滴定验证。
9.3.3.4 细胞培养板放置于5%(体积分数)CO2 细胞培养箱37℃孵育1h。
9.3.3.5 将孵育好的细胞培养板,每孔移取50μL至新的培养板中。每孔加50μL备好的E-derm 或
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RK-13细胞悬液(5×105 个/mL),5%(体积分数)CO2 细胞培养箱中37℃孵育2d~5d。
9.3.3.6 镜检观察:每天在倒置显微镜下观察细胞状态,记录观察结果。马甲疱疹病毒引起的CPE表
现为细胞圆缩、脱落、裂解。
9.3.3.7 细胞染色:培养物培养4d~7d后,若无CPE,另可倒去培养液,加入100μL细胞染色液,放
置15min后,自来水冲洗。完整单层细胞染成蓝色,而被病毒破坏的单层细胞不着色。
9.3.3.8 检查细胞对照、阳性血清对照、血清细胞毒性对照中细胞是否正常或染成蓝色,而阴性血清对
照和病毒对照是否出现CPE 或不着色,同时病毒对照中每孔加入的病毒量是否在101.5 TCID50 ~
102.5TCID50之间。
9.4 结果判定
9.4.1 各种对照试验成立,细胞对照、阳性血清对照、血清细胞毒性对照中细胞正常(无CPE)或染成蓝
色,而阴性血清对照和病毒对照出现CPE或不着色,同时病毒对照中病毒滴度与原测定滴度相差仍在
101.5TCID50~103TCID50之间,说明病毒稀释浓度符合微量血清中和试验的工作浓度。
9.4.2 未见细胞病变,判定为病毒中和试验阳性;病毒完全被中和(无CPE)的血清最高稀释度是该血
清的终点滴度。
9.4.3 出现细胞病变,判定为病毒中和试验阴性。
9.4.4 微量血清中和试验主要基于急性期和恢复期双份血清的抗体效价是否显著上升(4倍或以上)。
出现临诊症状(急性期)时应尽快采血,作为第一份血样,2周~4周后(恢复期)采集第二份血样。对比
急性期和恢复期的两份血清抗体效价,如效价升高4倍或以上,则判定为动物近期EHV 感染。
10 EHV-1/4通用抗体间接ELISA
10.1 仪器与设备
10.1.1 酶标仪。
10.1.2 洗板机。
10.1.3 恒温箱。
10.1.4 微孔板快速振荡器。
10.2 试剂与材料
10.2.1 EHV-1/4型通用抗原。
10.2.2 包被液,按照A.6配制。
10.2.3 PBST洗涤液,按照A.7配制。
10.2.4 封闭液,按照A.8配制。
10.2.5 阳性对照血清(商品化试剂)。
10.2.6 阴性对照血清(商品化试剂)。
10.2.7 兔抗马IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体,商品化试剂)。
10.2.8 底物溶液(商品化试剂)。
10.2.9 终止液,按照A.9配制。
10.2.10 加样槽。
10.2.11 可调微量移液器(1μL、100μL)。
10.2.12 96孔酶标板。
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GB/T27621—2024
10.3 试验方法
10.3.1 用包被液稀释EHV-1/4型通用抗原,包被96孔酶标板,每孔100μL,置于4℃过夜。
10.3.2 弃去孔内液体,每孔加入300μLPBST洗涤液,甩去孔内PBST 洗涤液,在洁净的吸水纸上轻
拍干,如此重复洗3次;也可用洗板机进行洗板。
10.3.3 加入封闭液,每孔200μL,置37℃恒温箱孵育90min。
10.3.4 同10.3.2进行第二次洗板。
10.3.5 用稀释液1∶100稀释6.5.3中血清样品,每孔加入100μL;同样,分别取阳性对照血清、阴性对
照血清1∶100稀释后,依次加入每孔100μL(设置复孔)。每块板设阴性对照血清和阳性对照血清各
两孔。37℃孵育1h。
10.3.6 同10.3.2进行第三次洗板。
10.3.7 用PBST稀释液将酶标抗体稀释至工作浓度,每孔加100μL,室温(10℃~30℃)孵育30min。
10.3.8 同10.3.2进行第四次洗板。
10.3.9 每孔加100μL新配制的底物溶液,室温(10℃~30℃)避光孵育15min。
10.3.10 每孔加100μL终止液,终止反应。
10.3.11 每孔加入终止液后5min内读取OD405nm值(波长405nm 处的光密度值)。
10.4 样品S/P 值计算方法
样品S/P 值按公式(2)计算:
S/P =ODS-ODN-C
ODP-C-ODN-C ……………………(2)
式中:
S/P ———样品数值;
ODS ———样品OD值;
ODP-C ———阳性对照平均OD值;
ODN-C ———阴性对照平均OD值。
10.5 试验成立条件
阳性对照血清两孔平均OD405nm 值大于1.0,阴性对照血清两孔平均OD405nm 值小于0.3时,反应
成立。
10.6 结果判定
计算血清样本的S/P 值。若被检血清样本的S/P 值≥0.3,判定为EHV-1或/和EHV-4抗体阳
性。被检血清样品的S/P 值<0.3,判定为EHV-1和EHV-4抗体阴性。
注:采用等效商品化试剂盒检测,按照使用说明书进行。
11 EHV-1/4分型鉴别间接ELISA
11.1 仪器与设备
11.1.1 酶标仪。
11.1.2 洗板机。
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GB/T27621—2024
11.1.3 恒温箱。
11.1.4 微孔板快速振荡器。
11.2 试剂与材料
11.2.1 EHV-1抗原:提纯的EHV-1特异性重组蛋白抗原。
11.2.2 EHV-4抗原:提纯的EHV-4特异性重组蛋白抗原。
11.2.3 包被液,按照A.6配制。
11.2.4 PBST洗涤液,按照A.7配制。
11.2.5 封闭液,按照A.8配制。
11.2.6 EHV-1阳性对照血清和EHV-4阳性对照血清(商品化试剂)。
11.2.7 阴性对照血清(商品化试剂)。
11.2.8 兔抗马IgG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体,商品化试剂)。
11.2.9 底物溶液(商品化试剂)。
11.2.10 终止液,按照A.9配制。
11.2.11 加样槽。
11.2.12 单孔道和多孔道可调微量移液器(1μL、100μL)。
11.2.13 96孔酶标板。
11.3 试验方法
11.3.1 用包被液稀释EHV-1或EHV-4抗原,包被96孔酶标板,每孔100μL,置于4 ℃放置16h~
24h。
11.3.2 弃去孔内液体,每孔加入300μLPBST洗涤液,甩去孔内PBST 洗涤液,在洁净的吸水纸上轻
拍干,如此重复洗3次;也可用洗板机进行洗板。
11.3.3 加入封闭液,每孔200μL,置37℃恒温箱孵育90min。
11.3.4 同11.3.2进行第二次选板。
11.3.5 用稀释液1∶100稀释6.5.3中血清样品。分别取阳性对照血清、阴性对照血清和稀释后待检
血清样品各100μL依次加入每孔(设置复孔),37℃孵育1h。
11.3.6 同11.3.2进行第三次选板。
11.3.7 用PBST稀释液将酶标抗体稀释至工作浓度,每孔加100μL,室温(10℃~30℃)孵育30min。
11.3.8 同11.3.2进行第四次选板。
11.3.9 每孔加100μL新配制的底物溶液,避光室温(10℃~30℃)放置10min。
11.3.10 每孔加100μL终止液,终止反应。
11.3.11 每孔加入终止液后5min内读取OD405nm值。
11.4 样品S/P 值计算方法
样品S/P 值计算同10.4。
11.5 试验成立条件
阳性对照血清两孔平均OD405nm值大于1.0,阴性对照血清两孔平均OD405nm值小于0.3时,反应成立。
11.6 结果判定
计算血清样本的S/P 值。若被检血清样本的S/P 值≥0.3,判定为EHV-1或EHV-4抗体阳性。
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GB/T27621—2024
被检血清样品的S/P 值<0.3,判定为EHV-1或EHV-4抗体阴性。
注:采用等效商品化试剂盒检测,按照使用说明书进行。
12 综合判定
12.1 依据第5章做出初步诊断,判为疑似EHV-1感染或者EHV-4感染。
12.2 经第7章或第8章方法检测为阳性时,判定为EHV-1感染或者EHV-4感染。
12.3 经第9章、第10章或第11章方法检测单份样品为阳性结果时,表明被检动物曾发生既往感染或
疫苗接种,应间隔14d~28d再次采样,采用第9章的诊断方法,当中和抗体效价升高4倍或4倍以上
时,且在第一次采样前28d内未进行相应疫苗接种,则可判定为EHV-1或者EHV-4新近感染。
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GB/T27621—2024
附 录 A
(规范性)
试剂配制方法
A.1 PBS(0.01mol/LPBS,pH7.4)
称取8.0g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.27g磷酸二氢钾
(KH2PO4),加去离子水溶解至1000mL,调节pH 至7.4,103kPa高压蒸汽灭菌30min,室温(10℃~
30℃)保存。
A.2 抗生素储存液溶液
用灭菌三蒸水配成每毫升10000IU 青霉素和10 mg 链霉素的抗生素贮存液,用微孔滤膜
(0.22μm)过滤除菌,分装成2mL/瓶,-20℃冻存备用。保存期不超过60d。
A.3 细胞染色液
2mg/mL结晶紫、10%(体积分数)福尔马林、45%(体积分数)甲醇和45%(体积分数)水。
A.4 细胞维持液
含2%灭活的无菌胎牛血清(FBS)的MEM 培养基。
A.5 细胞培养液
含10%灭活的无菌胎牛血清(FBS)的MEM 培养基。
A.6 包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液,pH9.6)
称取1.59g碳酸钠(Na2CO3)、2.93g碳酸氢钠(NaHCO3),将其溶于约950mL去离子水中,调节
pH 至9.6,定容至1000mL。4℃保存备用。
A.7 PBST洗涤液(含0.01mol/LPBS和0.05 %吐温-20,PH7.4)
称取8.0g氯化钠(NaCl)、0.2g氯化钾(KCl)、1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)、0.27g磷酸二氢钾
(KH2PO4),0.5mL吐温-20,加去离子水溶解至1000mL,调节pH 至7.4,现用现配。
A.8 封闭液
脱脂乳5g,加PBST定容至100mL,现用现配。
A.9 终止液(2mol/L硫酸溶液)
取分析纯浓硫酸(体积分数95%~98%)22.2mL缓缓加入177.8mL蒸馏水中,混匀即成2mol/L
H2SO4 终止液。
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GB/T27621—2024
附 录 B
(资料性)
核酸检测用引物、探针序列信息
B.1 实时荧光PCR 方法引物与探针
表B.1列出了实时荧光PCR引物信息。
表B.1 实时荧光PCR 引物信息表
扩增对象引物名称序列
EHV1第一对
引物(针对
ORF基因)
EHV-1F1 5'-CGTATTGGCATCTGAACCGC-3'
EHV-1R1 5'-CTACACGCCTTTGGTAGGG-3'
EHV-1P1 5'-FAM-CCCATAGTGGTACGCTCCGCCGATCTCT-BHQ1-3'
EHV1第二对
引物(针对
gC基因)
EHV-1F2 5'-GCGGGCTCTGACAACACAA-3'
EHV-1R2 5'-TTGTGGTTTCATGGGAGTGTGTA-3'
EHV-1P2 5'-FAM ‐ TAACGCAAACGGTACAGAA-BHQ1-3'
EHV4引物
EHV-4F 5'-TAGCAAACACCCACTAATAATAGCAAG-3'
EHV-4R 5'-GCTCAAATCTCTTTATTTTATGTCATATGC-3'
EHV-4P 5'-JOE-CGGAACAGGAACTCACTTCAGAGCCAGC-BHQ1-3'
B.2 特异性扩增片段序列
B.2.1 EHV-1第一对引物特异性扩增序列(99bp)
CGTATTGGCATCTGAACCGCTTGGAATACCCATAGTGGTACGCTCCGCCGATCTCTAC
AGATTTTCATCGAGTTTATTGACCCTACCAAAGGCGTGTAG
B.2.2 EHV-1第二对引物特异性扩增序列(64bp)
GCGGGCTCTG ACAACACAAC TAACGCAAAC GGTACAGAAT CTACACACTC CCATGAAACCACAA
B.2.3 EHV-4特异性扩增片段序列(96bp)
TAGCAAACACCCACTAATAATAGCAAGCAGGCTGGCTCTGAAGTGAGTTCCTGTTCCGT
TTGCGGCGCATATGACATAAAATAAAGAGATTTGAGC
</ct值<40且出现典型的扩增曲线,判为疑似。对疑似样本,应重复检测,ct