超清版 GB/T 44214-2024 蚕丝中非蚕丝蛋白物质含量试验方法

ICS 59.080.01
CCS W 40
中华人民共和国国家标准
GB/T 44214—2024
蚕丝中非蚕丝蛋白物质含量试验方法
Test method for non-protein content in silk
2024-07-24 发布2025-02-01 实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发 布

目　　次
前言 ····································································································· Ⅲ
1 范围 ·································································································· 1
2 规范性引用文件 ······················································································ 1
3 术语和定义 ··························································································· 1
4 原理 ·································································································· 1
5 试剂和材料 ··························································································· 1
6 仪器和设备 ··························································································· 2
7 试验步骤 ······························································································ 2
7.1 标准溶液配制 ···················································································· 2
7.2 缓冲液配制 ······················································································ 2
7.3 样品前处理 ······················································································ 3
7.4 衍生化操作 ······················································································ 3
7.5 萃取净化 ························································································· 3
7.6 测定 ······························································································ 3
8 结果计算与表示 ······················································································ 4
8.1 蚕丝中氨基酸含量分析 ·········································································· 4
8.2 非蚕丝蛋白物质含量分析 ········································································ 5
9 精密度 ································································································ 5
10 试验报告 ···························································································· 5
附录A （资料性） 四种氨基酸化合物信息 ···························································· 6
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Ⅰ

前　　言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国纺织工业联合会提出。
本文件由全国丝绸标准化技术委员会（SAC/TC 401）归口。
本文件起草单位：浙江丝绸科技有限公司、黄山市信达丝线有限公司、浙江蚕缘家纺股份有限公
司、苏州太湖雪丝绸股份有限公司、嵊州陌桑高科股份有限公司、苏州大学、苏州市纤维检验院、南通
市纤维检验所、浙江巴贝领带有限公司、达利丝绸（浙江）有限公司、南充银海丝绸有限公司、四川安
泰茧丝绸集团有限公司、浙江省检验检疫科学技术研究院、杭州市质量技术监督检测院、上海市质量监
督检验技术研究院、浙江生态纺织品禁用染化料检测中心有限公司、江苏工程职业技术学院、中芯创惟
生物科技(杭州) 有限公司、苏州市知识产权保护中心、绍兴市柯桥区中国轻纺城检验检测与标准化研
究院。
本文件主要起草人：吴国坚、伍冬平、陈思宇、孙晨晓、祁宁、刘雨、江朝辉、赵海浪、陈凤鸣、
刘伟、雷斌、倪学林、金丰、何国君、文朝钧、朱杨锐、杭志伟、李婷、曹石淼、陈志华、尹桂波、
潘璐璐、蒋伟、冯桂华、童珈珈。
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Ⅲ

蚕丝中非蚕丝蛋白物质含量试验方法
1　范围
本文件描述了测定蚕丝中非蚕丝蛋白物质含量的试验方法。
本文件适用于通过测定蚕丝中四种主要氨基酸（丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸）含量计算蚕丝
中非蚕丝蛋白物质的含量。
2　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用
于本文件。
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 8170　数值修约规则与极限数值的表示和判定
GB/T 9995　纺织材料含水率和回潮率的测定　烘箱干燥法
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
非蚕丝蛋白物质　non-protein content
蚕丝经水解后，未分解成氨基酸的物质总量，包括超过正常范围的游离NH4
+的量。
4　原理
蚕丝主要由丝素和丝胶组成，其在高温酸性溶液中可水解成游离氨基酸，与异硫氰酸苯酯反应后，
生成的氨基酸衍生物在紫外波长处有强吸收峰，经色谱柱分离后，采用高效液相色谱仪，对蚕丝中四种
主要氨基酸（丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸）进行测定。因蚕丝中氨基酸含量较为稳定，通过测定
蚕丝蛋白水解后氨基酸的含量，经过计算可得出蚕丝中非蚕丝蛋白物质的含量。
注：目前蚕丝中非蛋白物质主要有以甲基丙烯酰胺为单体的接枝聚合物。
5　试剂和材料
5.1　浓盐酸：优级纯。
5.2　乙腈：色谱纯。
5.3　异硫氰酸苯酯：纯度≥98%。
5.4　三乙胺：分析纯。
5.5　正己烷：色谱纯。
5.6　酸解溶液：6 mol/L 盐酸（5.1）溶液。
5.7　异硫氰酸苯酯﹘乙腈溶液（1 mol/L）：移取1.3 mL异硫氰酸苯酯于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容
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至刻度，混匀。
5.8　三乙胺﹘乙腈溶液（1 mol/L）：移取1.4 mL 三乙胺于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，
混匀。
5.9　水：符合GB/T 6682 二级水及以上要求。
5.10　氮气：纯度为99.99%。
5.11　氨基酸标准物质：丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）和酪氨酸（Tyr），化合物信
息见附录A，纯度均≥98%。
5.12　磷酸：纯度≥85%。
5.13　0.45 μm 水相滤膜。
5.14　0.45 μm 有机相滤膜。
6　仪器和设备
6.1　分析天平：分度值≤0.01 mg。
6.2　高效液相色谱仪（HPLC）：带二极管阵列检测器。
6.3　移液器：量程分别为10 μL～100 μL、100 μL～1 000 μL。
6.4　移液管：量程为1 mL～10 mL。
6.5　容量瓶：体积分别为10 mL、50 mL、100 mL 和1 000 mL。
6.6　超声波振荡器：频率≥40 kHz。
6.7　水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积为20 mL～100 mL。
6.8　真空泵。
6.9　恒温干燥箱：能控制温度在110 ℃±2 ℃。
6.10　水解炉。
6.11　旋转蒸发器。
6.12　水浴锅：能控制温度在55 ℃±2 ℃。
6.13　涡旋混匀仪。
7　试验步骤
7.1　标准溶液配制
7.1.1　混合氨基酸标准储备液配制
称取附录A 所列各氨基酸标准品适量（精确至0.01 mg），用水溶解，分别配制成质量浓度约为
1 000 mg/L 的储备液。储备液冷藏保存有效期为一个月。酪氨酸标准品可用0.1 mol/L 盐酸溶解。
7.1.2　混合氨基酸标准工作液配制
分别准确移取1 mL 标准储备液置于10 mL 容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀，即得到第一份
混合标准液。将第一份混合标准液用水逐级稀释，制成总共5 个不同浓度的系列混合标准工作液。5 个
浓度的混合标准工作液中各氨基酸质量浓度分别为1 0 m g / L 、2 0 m g / L 、4 0 m g / L 、8 0 m g / L 、
100 mg/L，现配现用。
7.2　缓冲液配制
磷酸缓冲液（10 mmol/L,pH=6.9）：移取0.68 mL 磷酸溶液（5.12）于1 000 mL 容量瓶中，用水
定容至刻度，混匀，pH 调节至6.9。
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7.3　样品前处理
7.3.1　桑蚕丝
7.3.1.1　取待测样品1 g，按GB/T 9995 规定烘至恒重。
7.3.1.2　使用分析天平称取100 mg 恒重后的样品置于试样瓶中，加入酸解溶液6 mol/L 盐酸（5.6）
20 mL，超声处理2 min，放置冰水（0 ℃）混合物中冷冻5 min，抽真空通入氮气3 次后密封，并放置于
110 ℃±2 ℃ 烘箱中水解24 h。
7.3.1.3　取出试样瓶，冷却至室温，过滤后移取1 mL 水解液，在旋转蒸发器（6.11）或水浴锅（6.12）
中55 ℃±2 ℃ 蒸发至干。准确加入10 mL 的水，超声处理，再加入10 mL 乙腈，充分溶解后离心或用
0.45 μm 水相微孔滤头过滤。
7.3.2　柞蚕丝
7.3.2.1　取待测样品1 g，按GB/T 9995 规定烘至恒重。
7.3.2.2　使用分析天平称取50 mg 恒重后的样品置于试样瓶中，加入酸解溶液6 mol/L（5.6）50 mL，
超声处理2 min，放置冰水（ 0 ℃ ）混合物中冷冻5 min，抽真空通入氮气3 次后密封，并放置于
110 ℃±2 ℃ 烘箱中水解48 h。
7.3.2.3　取出试样瓶，冷却至室温，过滤后移取1 mL 水解液，在旋转蒸发器（6.11）或水浴锅（6.12）
中55 ℃±2 ℃ 蒸发至干。准确加入10 mL 的水，超声处理，再加入10 mL 乙腈，充分溶解后离心或用
0.45 μm 水相微孔滤头过滤。
7.4　衍生化操作
样品经柱前衍生反应后采用高效液相色谱仪分析。具体衍生方法如下：
用移液器从试样（7.3.1.3 或7.3.2.3）中移取200 μL 溶液置于试样瓶内，加入1 mol/L异硫氰酸苯
酯﹘乙腈溶液100 μL 和1 mol/L 三乙胺﹘乙腈溶液100 μL，室温下放置1 h。
7.5　萃取净化
向经过衍生（7.4）的溶液中加入400 μL 正己烷，用涡旋混匀仪混匀。静置分层后取下层液，经
0.45 μm 有机相微孔滤头过滤（5.14），再进样分析。做两个平行试样。
7.6　测定
7.6.1　高效液相色谱参数参考条件
由于测试结果取决于所用的仪器，因此不可能给出分析的普遍参数，采用下列操作条件已被证明对
测试是合适的，高效液相色谱条件如下。
a)　色谱柱：C18 5 μm，4.6 mm×250 mm，或其他相当者。
b)　流动相A：10 mmol/L 磷酸缓冲液（pH=6.9）；流动相B：乙腈。
c)　柱温：40 ℃。
d)　流速：1.0 mL/min。
e)　检测波长：190 nm～370 nm，推荐波长254 nm。
f)　进样量：5 μL。
g)　洗脱方式：梯度洗脱，流动相及洗脱程序见表1。
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表1　高效液相色谱法洗脱程序
时间
min
流 动相
A
%
B
%
1 97 3
10 80 20
20 80 20
40 65 35
60 97 3
7.6.2　绘制标准工作曲线
启动高效液相色谱仪，设定工作参数，待基线稳定后，分别移取不同浓度的系列混合氨基酸标准工
作液（7.1.2），按照7.4 衍生化操作。衍生化完毕后，注入高效液相色谱仪进行测定，分别得到四种氨
基酸的峰面积。分别以各氨基酸峰面积为纵坐标、浓度为横坐标，建立标准工作曲线。通过保留时间识
别各氨基酸出峰顺序。在7.6.1 给出的条件下，混合氨基酸标准工作溶液色谱图见附录A。
7.6.3　定性
根据氨基酸标准品保留时间，与待测样品中组分的保留时间进行定性。
7.6.4　外标法定量
分析经过前处理（7.3）和衍生化（7.4）制备的试样，测定试样中各氨基酸色谱峰面积，由标准工
作曲线（7.6.2）计算试样中各氨基酸的浓度。
8　结果计算与表示
8.1　蚕丝中氨基酸含量分析
按公式（1）计算各氨基酸的含量：
Wi =
V
m103
D100 …………………………（1）
式中：
Wi ─ 试样中某种氨基酸所测得的含量，%；
ρ ─ 试样水解后测定的某种氨基酸的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；
V ─试样中水解定容体积，单位为毫升（mL）；
m ─试样质量，单位为毫克（mg）；
D ─稀释倍数。
所测四种氨基酸的总含量按公式（2）计算：
W =
Σ4
i=1
Wi …………………………（2）
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式中：
W ─ 试样中四种氨基酸所测得的含量，%；
Wi ─ 试样中某种氨基酸的含量，%。
以两个平行样测定结果的算术平均值为最终结果。
8.2　非蚕丝蛋白物质含量分析
非蚕丝蛋白物质含量按公式（3）计算:
R =
(
1? W
K
)
100 …………………………（3）
式中：
R ─ 非蚕丝蛋白物质的含量，%；
W ─ 试样中四种氨基酸所测得的含量，%；
K ─ 修正系数，88（桑蚕丝）或81（柞蚕丝）。
按GB/T 8170 进行数值修约，保留到小数点后两位。
注：增重处理过的蚕丝，其水解液一般有明显未溶解残渣，R 值可能为负值。
9　精密度
在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一被测对象相
互独立进行的测试获得的两次氨基酸总量的测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的
5%,以大于5% 的情况不超过5% 为前提。
10　试验报告
试验报告至少给出下列内容：
a） 样品的来源及描述；
b） 采用的标准编号；
c） 测试结果（四种氨基酸在试样中的含量、非蚕丝蛋白物质含量）；
d） 任何偏离本文件的细节；
e） 试验环境与设备；
f） 试验日期。
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附　录　A
（资料性）
四种氨基酸化合物信息
A.1　四种氨基酸化合物信息见表A.1。
表A.1　四种氨基酸化合物信息
序号中文名称英文和简写CAS号分子式相对分子质量
1 丝氨酸Ser 56﹘45﹘1 C3H7NO3 105.09
2 甘氨酸Gly 56﹘40﹘6 C2H5NO2 75.07
3 丙氨酸Ala 56﹘41﹘7 C3H7NO2 89.00
4 酪氨酸Tyr 60﹘18﹘4 C9H11NO3 181.19
A.2　四种氨基酸混合标准工作溶液色谱图见图A.1。
标引序号说明：
1─丝氨酸；
2─甘氨酸；
3─丙氨酸；
4─酪氨酸。
图A.1　四种氨基酸色谱图
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