【超清版】 GB/T 44708-2024 化学品 蚯蚓繁殖毒性试验

ICS 13.300
CCS A 80
中华人民共和国国家标准
GB/T 44708—2024
化学品　蚯蚓繁殖毒性试验
Chemicals—Earthworm reproduction toxicity test
2024-10-26 发布2025-05-01 实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会发 布

目　　次
前言 ····································································································· Ⅲ
1 范围 ·································································································· 1
2 规范性引用文件 ······················································································ 1
3 术语和定义、缩略语 ················································································· 1
4 受试物信息 ··························································································· 2
5 试验原理 ······························································································ 2
6 参比物 ································································································ 2
7 试验系统 ······························································································ 3
7.1 仪器设备 ························································································· 3
7.2 试验生物 ························································································· 3
7.3 试验土壤 ························································································· 3
8 试验程序 ······························································································ 4
8.1 受试物添加方式 ················································································· 4
8.2 暴露条件 ························································································· 4
8.3 预试验 ··························································································· 5
8.4 正式试验 ························································································· 5
8.5 限度试验 ························································································· 6
9 质量保证与质量控制 ················································································· 6
10 数据与报告 ·························································································· 6
10.1 数据处理 ························································································ 6
10.2 统计分析 ························································································ 7
10.3 试验报告 ························································································ 7
附录 A （资料性）　赤子爱胜蚓/安德爱胜蚓的驯养 ···················································· 9
附录 B （资料性）　土壤饱和持水量测定方法 ························································· 10
附录 C （资料性）　蚓茧孵出的幼蚓计数方法 ························································· 11
附录 D （资料性）　计算NOEC 的数据统计流程示意图 ·············································· 12
参考文献 ································································································ 13

前　　言
本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC 251）提出并归口。
本文件起草单位：生态环境部南京环境科学研究所、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、
上海市检测中心、中检科健（天津）检验检测有限责任公司、宁波海关技术中心、沈阳沈化院测试技术
有限公司、浙江省农业科学院、苏州华测安评技术服务有限公司。
本文件主要起草人：郭敏、石利利、王蕾、廖建华、刘纯新、吴文铸、葛海虹、周丽丽、朱昱璇、
杨希晨、袁野、刘汉伟、石凌锟、汤涛、皮天星、王雷、张雅静、李贝贝。

1　范围
本文件规定了化学品蚯蚓繁殖毒性试验的受试物信息、试验原理、参比物，试验系统、试验程序、
质量保证与质量控制、数据与报告的要求。
本文件适用于测试与评价化学品对蚯蚓繁殖的影响。
本文件不适用于易挥发的化学品，如空气﹘土壤分配系数大于1 的化学品，或蒸气压（25 ℃）大于
300 Pa 的化学品。
2　规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用
于本文件。
GB/T 21801　化学品　快速生物降解性　呼吸计量法试验
GB/T 21802　化学品　快速生物降解性　改进的MITI 试验（Ⅰ）
GB/T 21803　化学品　快速生物降解性　DOC 消减试验
GB/T 21809　化学品　蚯蚓急性毒性试验
GB/T 21831　化学品　快速生物降解性：密闭瓶法试验
GB/T 21845　化学品　水溶解度试验
GB/T 21852　化学品　分配系数（正辛醇﹘水）高效液相色谱法试验
GB/T 21853　化学品　分配系数（正辛醇﹘水）摇瓶法试验
GB/T 21855　化学品与pH 有关的水解作用试验
GB/T 21856　化学品　快速生物降解性　二氧化碳产生试验
GB/T 21857　化学品　快速生物降解性　改进的OECD 筛选试验
GB/T 22228　工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-1 Pa 至105 Pa 范围内的测定　静态法
GB/T 22229　工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-3 Pa 至1 Pa 范围内的测定　蒸气压平衡法
GB/T 27850　化学品　快速生物降解性　通则
3　术语和定义、缩略语
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　效应浓度　effect concentration；ECx
在给定测试周期内，与对照组相比，导致x% 受试生物出现某观察效应的受试物浓度。以每单位试
验土壤（以干重计）所含的受试物量表示。
3.2　非致死浓度　no lethal concentration；LC0
在给定测试周期内，未导致任何受试生物死亡的最高受试物浓度。以每单位试验土壤（以干重计）
所含的受试物量表示。
GB/T 44708—2024
1
3.3　半数致死浓度　median lethal effect concentration；LC50
在给定测试周期内，造成50% 受试生物死亡的受试物浓度。以每单位试验土壤（以干重计）所含的
受试物量表示。
3.4　全致死浓度　totally lethal concentration；LC100
在给定测试周期内，导致100% 受试生物死亡的最低受试物浓度。以每单位试验土壤（以干重计）
所含的受试物量表示。
3.5　最低可观察效应浓度　lowest observed effect concentration；LOEC
在给定测试周期内，与对照组相比，在统计学意义上对受试生物产生显著效应（p＜0.05）的最低受
试物浓度。以每单位试验土壤（以干重计）所含的受试物量表示。
3.6　无可观察效应浓度　no observed effect concentration；NOEC
在给定测试周期内，与对照组相比，在统计学意义上对受试生物未产生显著效应（p≥0.05）的最高
受试物浓度。
3.7　繁殖率　reproduction rate
在试验期间，每条成蚓所产生幼蚓的平均数。
4　受试物信息
试验前应获得下列受试物信息：
标识信息[通用名、国际纯粹与应用化学联合会名（IUPAC名）、化学文摘社号（CAS号）]，
化学纯度；
a）
b） 按照GB/T 21845方法测定的水中溶解度；
c） 按照GB/T 22228或GB/T 22229测定的蒸气压；
d） 按照GB/T 21852或GB/T 21853测定的正辛醇﹘水分配系数；
环境中稳定性（如按照GB/T 21855测定的水解作用，按照GB/T 27850、GB/T 21801、GB/T 21802、
GB/T 21803、GB/T 21831、GB/T 21856、GB/T 21857测定的生物降解作用）。
e）
5　试验原理
根据受试物的施用方式（混合染毒或表面染毒），制备含不同浓度受试物的土壤样品系列，将成蚓
暴露于其中，该浓度系列中应包含8 周试验期内可能引起亚致死和致死效应的浓度。暴露4 周后测定成
蚓的死亡率和生长受影响情况，然后将成蚓从土壤中移出，继续培养4 周后观察、统计子代蚯蚓的数
量，计算繁殖量，通过统计分析受试组和对照组繁殖量的差异，确定LOEC 和NOEC。也可通过回归模
型分析估算引起繁殖量减少x% 的浓度，即ECx（如EC10，EC50）。
6　参比物
为检验受试生物的活性和试验条件的有效性，应设置参比物试验。宜选择多菌灵或苯菌灵作为参比
物。若选择其他参比物，试验报告中应说明选择依据及有效性判定标准。
参比物试验每年应至少进行一次测试，或在测试频率较低的情况下，与毒性测试同时进行。
GB/T 44708—2024
2
7　试验系统
7.1　仪器设备
除常规实验室仪器设备外，还需要以下设备。
试验容器：由玻璃或其他化学惰性材料制成，容积为1 L~2 L。容器横截面积约200 cm2，以保
证添加500 g~600 g干土后，润湿的试验土壤深度达到5 cm~6 cm。容器盖（如多孔的透明盖）
应确保试验土壤与大气之间进行空气交换、透光并防止蚯蚓逃逸。
a）
b） 烘箱。
c） 体视显微镜。
d） pH计。
e） 天平（精度为0.001 g、0.000 1 g）。
f） 湿度计。
g） 温度计。
h） 搅拌设备或混合装置。
i） 生态箱或恒温室：光强为400 lx～800 lx，温度为 20 ℃± 2 ℃，相对湿度为60%～80%。
j） 水浴锅。
k） 光度计等分析仪器。
7.2　试验生物
7.2.1　推荐的试验生物为赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）或安德爱胜蚓（Eisenia andrei），应使用3 月
龄~1 年龄有环带的成蚓。应选择同批培养、蚓龄结构相似（见附录A）的个体，且同一试验中个体蚓
龄差异不应超过4 周。
7.2.2　试验前，蚯蚓应在人工土壤中驯养至少1 d。驯养期间的食物应与试验期间相同。
7.2.3　试验开始时，将每组10 条蚯蚓清洗后快速用滤纸去除多余水分，称量总重后放入试验容器中。
单条赤子爱胜蚓的湿重应为300 mg～600 mg，单条安德爱胜蚓的湿重应为250 mg～600 mg。
7.3　试验土壤
7.3.1　人工土壤试验基质成分如下（基于干重，在105 ℃ 下干燥至恒重）：
—草炭10%（pH5.5～6.0，磨细，无明显植物残体，风干，测定含水量）；
—高岭土20%（高岭土含量不小于30%）；
—碳酸钙0.3%～1.0%（粉末状，分析纯，用于调节土壤初始pH至6.0±0.5）；
风干的石英砂70%（取决于碳酸钙的使用量，以细砂为主，50 μm～200 μm粒径的细砂含量
50%以上）。
—
注1：试验前采集土壤子样本测定土壤介质的构成，以确定碳酸钙的用量。将混匀的样品加至1 mol/L KCl 或0.01 mol/L
CaCl2 溶液中测定pH。
注2：通过调整草炭含量至4%~5%、增加石英砂含量以降低人工土壤总有机碳含量，减少土壤对受试物的吸附，
提高受试物对蚯蚓的生物可利用度。
注3：使用自然土壤开展试验时，需验证自然土壤的适用性和试验有效性标准。
7.3.2　土壤的干组分应充分混匀。试验开始前，用适量去离子水润湿混匀的人工土壤，使其含水量达到
饱和持水量的40%～60%，测定方法见附录B，相当于干重含水量50%±10%。
7.3.3　如果受试物直接加入土壤混合物中，在制备人工土壤时可直接调节含水量至试验要求；如果受试
物以水溶液加至土壤中，试验前应计算达到试验要求的含水量所需的水溶液体积，并配制相应体积不同
浓度的受试物水溶液（8.1.2）。
GB/T 44708—2024
3
8　试验程序
8.1　受试物添加方式
8.1.1　概述
根据试验目的和受试物的水溶解性确定受试物添加方式。宜采用受试物与土壤均匀混合的方式，也
可采用液体喷洒等方式将受试物加至土壤表面。当使用有机溶剂助溶时，应选择对蚯蚓毒性小的溶剂，
且试验时应设溶剂对照。
8.1.2　可溶于水的受试物
试验开始前，根据每个试验浓度的平行数及每份土壤最终含水量达到饱和持水量的40%～60% 的
要求，计算水溶液需要量，用去离子水配制足够量的受试物水溶液。将受试物水溶液与土壤完全混匀后
装入试验容器。
8.1.3　不溶于水但溶于有机溶剂的受试物
将受试物溶于少量合适的有机溶剂中，如丙酮，然后喷洒在少量石英砂表面或与少量石英砂混合，
并置于通风橱至少几分钟，挥发除去有机溶剂后将石英砂与预先润湿的人工土壤充分混匀。再添加少量
去离子水使土壤含水量达到饱和持水量的40%～60% 并混匀。最后将土壤装入试验容器中。不应使用
对蚯蚓有毒的有机溶剂。
8.1.4　不溶于水和有机溶剂的受试物
按照试验浓度准确称取受试物，并与10 g 石英砂充分混合。然后将混合物与预先润湿的人工土壤充
分混匀。添加适量去离子水使土壤含水量达到饱和持水量40%～60%，最后将土壤装入试验容器中。
8.1.5　需添加至土壤表面的受试物
受试物添加步骤如下。
应在引入蚯蚓后对土壤进行染毒处理。先将湿润土壤介质装入试验容器，再将称重之后的蚯蚓
放至土壤表面。健康蚯蚓通常很快便钻入土壤中，15 min后仍停留在土壤表面的个体被认为有
损伤，应替换为健康蚓。如果有需要替换的蚯蚓，新引入的个体和替换个体都应称重，以确定
整个试验容器中蚯蚓的初始体重。
a）
应在引入蚯蚓0.5 h后添加受试物开展暴露试验，以免造成受试物对蚯蚓体表的直接暴露。当加
入的蚯蚓均转入土壤后，使用适宜的喷洒装置将配制好的受试物均匀喷洒在土壤表面，喷洒前
应先移去容器盖子，并在容器内加一个衬里，以避免受试物喷洒到试验容器壁上。喷洒时室内
温度应保持在20 ℃±2 ℃，喷施速度应介于600 μL/m2~800 μL/m2，受试物喷施速度应使用适宜
的方法进行校准。
b）
试验容器应保持至少1 h不加盖，便于挥发去除土壤混合物中的有机溶剂，应注意此过程无蚯蚓
逃逸。
c）
8.2　暴露条件
每次试验暴露条件如下。
a） 暴露时间：8 周。
b） 温度：20 ℃±2 ℃。
c） 光照：试验应在光暗可控的条件下进行，最适光暗比 16 h∶8 h，光照强度为400 lx ~800 lx。
d） 水分：试验期间应维持试验土壤的含水量，宜通过定期称量去掉盖子后试验容器的质量以确定
GB/T 44708—2024
4
是否有变化。必要时，应补充损失的水分。与试验开始时相比，含水量变化不应超过10%。
氧气：试验期间不充氧。每周开启一次容器进行饲喂可确保提供足够的空气交换量。试验容器
的盖子应确保试验土壤与外界空气的气体交换，同时控制水分蒸发损失。
e）
喂食：可选择能维持蚯蚓在试验期间体重的任何食物，如燕麦片、自然风干的牛粪、马粪。应
确认马粪、牛粪的来源及保存条件，同时确保相应的牛、马没有经过任何药物处理，如使用生
长剂、杀虫剂及其他兽药。粪便使用前应风干、磨细、巴氏消毒处理。
f）
应在试验开始1 d 后喂食。将大约5 g 自然风干、磨碎的食物撒在每个容器的土壤表面，并用5 mL～6 mL
的水润湿。前4 周每周添加一次食物，如果表面有未被食用的食物则宜减少饲喂量，以免真菌滋生而变
质。成蚓应在试验开始后第28 d 移出，同时每个容器补充5 g 食物。剩余的4 周不再喂食。
8.3　预试验
8.3.1　预先了解受试物毒性信息有助于选择合适的试验浓度，如按照GB/T 21809 方法测定的急性毒性
数据和/或预试验数据。如无必要的毒性数据时，应开展预试验。
8.3.2　预试验宜设5 个浓度，如0.1 mg/kg（土壤干重）、1.0 mg/kg（土壤干重）、10 mg/kg（土壤
干重）、100 mg/kg（土壤干重）和1 000 mg/kg（土壤干重），并应设空白对照。预试验不设平行，
暴露时间为2 周，其他试验条件见 8.2。试验结束时应测定蚯蚓死亡数、评估死亡率，以确定正式试验
的浓度范围。
8.4　正式试验
8.4.1　浓度组别设计
根据不同试验目的设置正式试验的受试浓度组别。
确定NOEC：正式试验应按几何级数设置至少5 个浓度组，浓度间距公比不超过2，每个浓度组
设4 个平行。同时设置空白对照组，对照组为8 个平行。
a）
确定ECx（如EC10，EC50）：应设置足够数量的受试浓度组，以确保至少4 个浓度组的观测效应
与对照组相比具有统计学意义的显著性差异。每个浓度组至少2 个平行，对照组至少6 个平行。
浓度间距公比可以不同，在预计产生效应的浓度区间内间距公比应不大于1.8，区间外的高/低
浓度的间距公比可大于1.8。
b）
确定NOEC和ECx：应按几何级数设置至少8 个浓度组，且浓度间距公比不大于1.8，每个浓度组
应设4 个平行。同时设置空白对照组，对照组为8 个平行。
c）
8.4.2　试验操作
8.4.2.1　从同一批蚯蚓群体中随机抽取20 条蚯蚓，分别称重后以确定其均一性。确保均一性后，挑取
一批蚯蚓，称重后将蚯蚓随机投入装有含受试物土壤的试验容器中，每平行10 条蚯蚓。放入蚯蚓后，
每个试验容器称重作为试验过程中监测土壤含水量的基础。将容器盖好，转入恒温室或生态培养箱。
8.4.2.2　除不添加受试物外，空白对照组所有的操作应与受试组相同，包括有机溶剂、石英砂或其他媒
介的用量。
8.4.2.3　试验开始后第28 d，应对存活的成蚓进行观察、计数、称重，并记录非正常行为（如丧失钻孔
能力、趴在容器壁不动）和形态学变化（如有伤口）。为便于观察和计数，可将试验容器中含有蚯蚓的
土壤全部转移至干净的托盘中，移取所有成蚓并称重。蚯蚓称重前应用去离子水洗净并用滤纸吸去水
分。未找到的成蚓记录为死亡。存活成蚓应采取安乐死处置，最好是在-80 ℃ 下快速冷冻或冷冻保存。
8.4.2.4　移出成蚓后，含有蚓茧的土壤应全部放回容器并在相同条件下继续培养4 周，这段试验仅在开
始时喂食一次。试验结束时，统计幼蚓数量（见附录C）和蚓茧数量，并记录所有中毒体征及可能的
伤害。
GB/T 44708—2024
5
8.4.3　分析测定
8.4.3.1　试验开始和结束时测定所有受试浓度组和对照组土壤含水量、pH，不管受试物是酸性或碱性物
质，均不可以调节pH。
8.4.3.2　应确保受试物在试验过程中无降解。对于易挥发、不稳定或易降解的物质，应在试验开始和试
验结束时测定受试物的浓度。
8.5　限度试验
如果预试验显示最高浓度[1 000 mg/kg（土壤干重）] 无中毒效应，可开展限度试验，设置受试浓度为
1 000 mg/kg（土壤干重），受试组和对照组均设8 个平行，暴露条件见8.2，试验操作见8.4.2。若繁殖
毒性NOEC 大于1 000 mg/kg（土壤干重），可判断受试物对蚯蚓繁殖无影响。
9　质量保证与质量控制
质量控制条件包括：
a） 试验结束时，对照组每个平行（包含10 条成蚓）的受试蚯蚓繁殖的幼蚓数应不少于30；
b） 对照组繁殖量的变异系数不大于30％；
c） 最初4周内对照组成蚓死亡率不大于10%；
d） 试验结束时与试验开始时含水量的变化率不大于10％；
参比物多菌灵与苯菌灵对蚯蚓的繁殖影响显著效应浓度为1 mg a.i./kg（土壤干重）～5 mg
a.i./kg（土壤干重）或250 g a.i./ha~500 g a.i./ha或25 mg a.i./m2~50 mg a.i./m2。
e）
10　数据与报告
10.1　数据处理
X
S 2
每个浓度处理和空白对照繁殖量的算数平均数（ ）按公式（1）进行计算，每个浓度处理和空白
对照繁殖量的方差（ ）按公式（2）进行计算：
?X
=
Σk i=1 Xi
k
…………………………（1）
S 2 =
1
k?1
2666666664Σki
=1 X2
i
?
[Σk i=1 Xi
]2
k
3777777775
…………………………（2）
式中：
X ─ 繁殖数量的平均值；
k ─ 受试浓度组数量；
Xi ─ 试验期间容器 i 产生的幼蚓数；
S 2 ─ 每个处理组的方差。
X用于方差分析（ANOVA），如 t 检验（t﹘test）、Dunnett’s 检验或Williams 检验，以及95% 置
信区间的计算。
GB/T 44708—2024
6
10.2　统计分析
10.2.1　LC50 的计算
可采用剂量反应分析法，如Probit 分析或对数回归分析确定LC50。当以上统计方法不适用时（例如
出现成蚓死亡的浓度组少于3 个），宜选用其他统计方法，如移动平均法、修正的Speanman﹘Karber 方
法或简单内插法（如LC0 和LC100 的几何平均值）。
10.2.2　NOEC 的确定
10.2.2.1　应采用方差分析（ANOVA）对各处理组和对照组数据（如体重变化、子代数量等繁殖力参
数）的正态性和方差齐性进行分析，然后采用方差分析，如果数据（或经转换后的数据）服从正态分布
且方差齐性，应采用多重t 检验（multiple t﹘tests）统计学方法，如Williams 检验（α=0.05，单边）或
Dunnett’s 检验，用来比较受试物处理组和对照组之间的显著性差异，以确定NOEC。如果数据不服从
正态分布或方差齐性时，则应采用非参数检验方法，如邓恩检验（Dunn’s test）或邦费罗尼检验
（Bonferroni﹘U tests）。当数据方差不齐但符合单变量剂量﹘效应关系时，可使用其他非参数检验（如
Jonckheere﹘Terpstra 趋势检验或 Shirley 检验）。
10.2.2.2　对于限度试验，如果试验结果满足参数检验程序的先决条件（如正态性、方差齐性），可使
用双样本Student﹘t 检验，否则采用曼﹘惠特尼U 检验（Mann﹘Whitney﹘U test）或者其他合适的非参数
检验方法（见附录D）。
10.2.3　ECx 的计算
若繁殖率观察效应参数呈现出剂量反应关系，应采用适宜的剂量反应分析法，计算ECx 值及其置信
区间。应按照数据特点，选择合适的模型，如Probit、Logit 和Weibull 的广义线性及非线性模型，进行
拟合以求取ECx 值。ECx 应包含在试验浓度范围内，ECx 的计算来自内插法而不是外推法。
10.3　试验报告
试验报告应包括以下内容。
a） 受试物：
—基本信息：包括名称、分子式、分子量、纯度、杂质等；
—理化性质：如外观、logKow、logKoc、水溶解度、蒸气压、亨利常数、降解性等。
b） 试验生物：
—品系、学名、来源和培养条件；
—蚓龄、体重范围。
c） 试验条件：
—试验土壤的制备；
—土壤饱和持水量；
—土壤中受试物添加方法；
—助溶剂或媒介使用情况；
—试验设计和试验程序；
—试验容器尺寸和土壤添加量；
—暴露时间、光强、温度；
—喂食方案、所用食物种类和量、喂食日期；
—试验开始和结束时土壤pH和含水量。
GB/T 44708—2024
7
d） 试验结果：
—试验开始时每个容器中成蚓的总体重；
—第一个4周结束时每个试验容器中成蚓的死亡率（%）；
—第一个4周结束时每个试验容器中存活成蚓的总体重；
—第一个4周结束时每个容器中成蚓的体重变化（占初始体重的百分数）；
—试验结束时每个容器中幼蚓的数量；
—明显的中毒症状或特殊的行为变化的描述；
—参比物试验结果；
—试验结果，NOEC、ECx及95%置信区间和计算方法的描述；
—剂量﹘效应关系曲线；
—偏离本文件所描述的试验程序和试验中出现的异常现象。
e） 结果讨论。
GB/T 44708—2024
8
附　录　A
（资料性）
赤子爱胜蚓/安德爱胜蚓的驯养
A.1　饲养宜在人工气候室20 ℃±2 ℃ 下进行。在该温度和充足的食物条件下，蚯蚓会在2 月～3 月发育
成熟。
A.2　两个品种均可采用动物粪便驯养。宜采用50∶50 的马粪（或牛粪）与草炭混合。培养基质的
pH 应为6～7，可用碳酸钙调节pH，电导率应小于6 mg 或0.5% 的盐浓度，并且不能被氨或动物尿液污
染。培养介质应润湿但不能过湿。饲养箱的容积宜为10 L～50 L。
A.3　要获得标准蚓龄和体重的蚯蚓，宜从蚓茧开始培养。从开始培养起，应将成蚓放在装有新鲜培养
基质的饲养箱14 d～28 d 使其产生新茧。然后将成蚓移出，由茧孵出的幼蚓用作下一批成蚓的培养。蚯
蚓应不断的用饲料喂养并经常更换新的培养基质。由茧孵出的蚯蚓生长成熟至3 月～12 月时可用于
试验。
A.4　如果蚯蚓在培养基质中正常移动，并未试图逃离基质且不断繁殖，可判定蚯蚓健康。若蚯蚓移动
缓慢和尾部变黄，表示基质可能耗尽，应补充新鲜的基质或减小饲养密度。
GB/T 44708—2024
9
附　录　B
（资料性）
土壤饱和持水量测定方法
用合适的采样装置（如钻管）取一定量（如5 g）试验土壤，用浸满水的滤纸将管的底部盖住然后
置于水槽的架子上。将管慢慢地没入水中直到水面超过土壤的顶部，使其在水中浸没约3 h，然后将管
取出并放置在湿润且磨细的石英砂床上2 h 以排出土壤中多余的水，石英砂床应置于有盖的容器中。样
品称重，然后置于105 ℃ 下烘干至恒重，再进行称重。饱和持水量（WHC）按公式（B.1）进行计算：
WHC（%，以干重计） =
S ?T ?D
D
100 …………………………（B.1）
式中：
S ─ 总质量（水饱和土壤＋管子质量＋滤纸质量），单位为克（g）；
T ─ 皮重（管子质量＋滤纸质量），单位为克（g）；
D ─ 土壤干重，单位为克（g）。
GB/T 44708—2024
10
附　录　C
（资料性）
蚓茧孵出的幼蚓计数方法
C.1　幼蚓数量的统计可采用以下两种方法。
加温法。将试验容器放入初始温度为40 ℃的水浴中，升温至60 ℃，大约20 min后，幼蚓会爬到
土壤表面，可将幼蚓移出并计数。该法适用于提取可能会被b）中0.5 mm筛子洗出去的幼蚓。
a）
筛分法。如果草炭和牛粪加入土壤前是磨碎的粉状，可将试验土壤过筛淋洗。将两个0.5 mm网
孔的筛子（直径30 cm）叠放在一起，用自来水强水流（宜采用喷头）冲洗试验容器中的内容
物，使幼蚓和蚓茧保留在上层筛子。应特别注意，操作过程中上层筛子的整个表面应保持湿
润，使幼蚓能漂浮在水膜上，防止它们爬过筛孔。土壤淋洗完全后，将幼蚓和蚓茧从上层筛子
冲到烧杯里。静置后，使空的蚓茧漂浮至水面，而实的蚓茧和幼蚓沉至水底。然后把水倒掉，
将幼蚓和蚓茧转移至装有少量水的培养皿中，可辅以针或镊子数出蚯蚓数目。
b）
C.2　如果采用手工收集并计数幼蚓数量，所有样品应重复操作两次。
GB/T 44708—2024
11
附　录　D
（资料性）
计算NOEC 的数据统计流程示意图
计算NOEC 的数据统计流程示意如图D.1 所示。
图D.1　计算NOEC 的数据统计流程示意图
GB/T 44708—2024
12
参　考　文　献
[1]　GB/T 21851　化学品　批平衡法检测　吸附/解吸附试验
[2]　GB/T 27860　化学品　高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数
[3]　LY/T 1239　森林土壤pH 值的测定
[4]　ISO 11268﹘2:2023　土壤质量　污染物对蚯蚓的影响　对赤子爱胜蚓/安德爱胜蚓繁殖影响的
测定（Soil quality﹘Effects of pollutants on earthworms﹘Determination of effects on reproduction of
Eisenia fetida / Eisenia andrei）
[5]　OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS. Earthworm Reproduction Test
(Esienia fetida/Eisenia Andrei). 13 April 2016.
[6]　EPA Ecological Effects Test Guidelines. OCSPP 850.3100: Earthworm Subchronic Toxicity Test.
January 2012.
[7]　OECD Guidance document No. 54: Current approaches in the statistical analysis of ecotox﹘
icity data: a guidance to application, 2006.
—
GB/T 44708—2024
13