T/CAB 0363-2024 基于CRISPR Cas9的植物靶向基因转录激活载体设计和构建方法

ICS 07.080
A20
团体标准
T/CAB 0363—2024
基于CRISPR/Cas9的植物靶向基因转录激活载体设计和构建方法
Design and construction method for vector for CRISPR/Cas9-based targeted transcriptional activation in plants
2024-10-28发布 2024-10-28实施
中国产学研合作促进会 发布

目 次
前 言 .......................................................................... II
引 言 ......................................................................... III
1 范围........................................................................... 1
2 规范性引用文件 ................................................................. 1
3 术语和定义 ..................................................................... 1
4 原理........................................................................... 1
5 缩略语......................................................................... 2
6 试剂和材料 ..................................................................... 3
7 仪器设备 ....................................................................... 4
8 操作步骤 ....................................................................... 5
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II
前 言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由中山大学提出。
本标准由中国产学研合作促进会归口。
本标准起草单位：中山大学生命科学学院、中国农业科学院农业基因组研究所、中国标准化研究院。
本标准主要起草人：李剑峰、黎镇祥、熊翔宇、王凤珠、赵琳、闫建斌。
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III
引 言
基因过量表达是研究植物基因功能的重要手段，同时也是改良作物农艺性状的有效途径。靶向基因转录激活技术是一种新兴的基因过量表达技术，该技术利用人工设计的转录激活因子特异地结合至靶基因的启动子区域，实现对内源靶基因转录水平的原位激活。其中，基于CRISPR/Cas9的靶向转录激活技术具有设计简单、操作方便、通量高等特点，已被成功应用于拟南芥、烟草、水稻、棉花等多种植物中。本文件旨在描述基于CRISPR/Cas9的植物靶向基因转录激活载体设计和构建方法，对于指导和规范植物学研究和农业生产中CRISPR/Cas9靶向基因转录激活技术的应用具有重要意义。

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1
基于CRISPR/Cas9的植物靶向基因转录激活载体设计和构建方法
1 范围
本文件规定了基于CRISPR/Cas9的植物靶向基因转录激活载体设计和构建方法的原理、试剂和材料、仪器设备和操作步骤。
本文件适用于拟南芥、水稻等常见植物的CRISPR/Cas9靶向基因转录激活载体的设计与构建。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 34796 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法
GB/T 40170 质粒抽提及检测通则
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
成簇的规律性间隔的短回文重复序列及其关联蛋白9 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9；CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas系统是原核生物用于抵御外源遗传物质入侵的适应性免疫系统，包含CRISPR基因座和Cas基因两部分。CRISPR/Cas9属于II型CRISPR/Cas系统，后来被开发成一种高效的基因编辑工具,该工具包括两种作用元件：单一向导RNA（single guide RNA, sgRNA）和Cas9核酸酶。CRISPR/Cas9基因编辑技术利用人工设计的sgRNA，通过碱基互补配对识别目的基因序列，引导Cas9核酸酶在靶位点处切割DNA，形成双链断裂，进而诱发细胞内源DNA损伤修复途径，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。
3.2
基因转录 gene transcription
以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，在RNA聚合酶作用下合成RNA的过程。
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3.3
靶向基因转录激活 targeted gene transcriptional activation
利用人工转录激活因子特异地激活靶基因的转录，而不影响其他基因的转录水平。
3.4
载体 vector
携带目的基因表达框的质粒DNA，可用于植物瞬时基因表达和稳定遗传转化。
3.5
启动子 promoter
位于结构基因转录起始位点上游的一段非编码DNA序列，含有RNA聚合酶和转录因子的结合位点。在转录过程中，RNA聚合酶与转录因子可以识别并特异性结合到启动子特有的DNA序列，从而启动下游结构基因的转录。
4 原理
通过氨基酸突变破坏Cas9的核酸酶活性中心，可使其转变成失活的Cas9（dead Cas9, dCas9）；dCas9不能切割DNA，但仍然保留了在sgRNA引导下特异结合到靶位点的能力。把dCas9与复合型转录激活结构域TV进行融合，可获得dCas9-TV人工转录激活因子；dCas9-TV在特定sgRNA的引导下结合到靶基因的启动子区域时，由TV转录激活结构域招募细胞内源转录装置到该基因启动子，从而上调靶基因的转录水平。通常情况下，在靶基因转录起始位点上游200 bp的启动子区域内设计sgRNA，可获得最优的转录激活效果。设计特定靶序列后，通过重叠PCR组装相应的sgRNA表达框，并利用限制性核酸内切酶和T4连接酶把sgRNA表达框连接至含有dCas9-TV表达框的载体上，构建可用于植物瞬时表达和稳定遗传转化的载体。
5 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
5’ UTR：5’非翻译区（5’ untranslated region）
bp：碱基对（Base pair）
CIAP：牛小肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase）
DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside triphosphate）
EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）
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kb：千碱基对（Kilobase pair）
PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain ）
RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）
rpm：转每分（Revolutions per minute）
Tris：三羟甲基氨基甲烷 [Tris(hydroxymethyl)aminomethane]
6 试剂和材料
除非另有规定，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水须GB/T 6682中一级水的要求。
6.1 pUC119-AtU6_26-sgRNA质粒
6.2 pUC119-OsU6a-sgRNA质粒
6.3 DNA聚合酶
6.4 5×PCR反应缓冲液
6.5 10 mM dNTP混合液
6.6 10×DNA上样缓冲液
6.7 琼脂糖
6.8 10000×核酸染料
6.9 胶回收和PCR产物纯化试剂盒
6.10 限制性内切酶AscI
6.11 10×酶切反应缓冲液
6.12 pFGC-dCas9-TV质粒
6.13 pCAMBIA-dCas9-TV质粒标题
6.14 CIAP
6.15 T4 DNA连接酶
6.16 10×T4 DNA连接酶反应缓冲液
6.17 大肠杆菌DH5α感受态细胞
6.18 质粒DNA提取试剂盒
6.19 0.5 mol/L EDTA溶液
称取186.10 g EDTA固体，加入800 mL超纯水溶解，用NaOH调pH至8.0，补加超纯水定容至1 L，121 ℃高压灭菌15 min。
6.20 50×TAE缓冲液
称取242.00 g Tris碱，加入800 mL超纯水充分溶解，随后加入20 mL 0.5 mol/L EDTA溶液和57.1 mL醋酸，补加超纯水定容至1 L。
6.21 1×TAE缓冲液
量取20 mL 50×TAE缓冲液，加入980 mL超纯水，充分摇匀备用。
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6.22 琼脂糖凝胶
分别称取0.60 g、1.00 g和1.20 g琼脂糖粉末于100 mL三角瓶中，加入100 mL 1×TAE缓冲液，加热摇晃混匀，直至琼脂糖完全熔化，冷却至约55 ℃后加入10 μL 10000×核酸染料，摇匀后倒入插有梳子的胶模中，完全冷却凝固后得到0.6%、1.0%和1.2%的琼脂糖凝胶。
6.23 50 mg/mL卡那霉素贮备液
称取0.50 g卡那霉素粉末，加入10 mL灭菌超纯水溶解，在超净工作台中经0.22 μm滤膜过滤后，分装至1.5 mL灭菌离心管中，保存于-20 ℃。
6.24 LB固体培养基
称取10.00 g胰蛋白胨、5.00 g酵母提取物、10.00 g NaCl，溶于800 mL超纯水中，用NaOH调pH至7.4，定容至1L，加入15.00 g琼脂粉末，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至55 ℃后，在超净工作台中加入1 mL卡那霉素贮备液，摇匀后倒入90 mm培养皿中，待凝固后晾干冷却备用。
6.25 LB液体培养基
称取10.00 g胰蛋白胨、5.00 g酵母提取物、10.00 g NaCl，溶于800 mL超纯水中，用NaOH调pH至7.4，定容至1L，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至55 ℃后，在超净工作台中加入1 mL卡那霉素贮备液，摇匀备用。
7 仪器设备
7.1 可调微量移液器。
7.2 离心机：离心力17000 g。
7.3 PCR仪。
7.4 水平电泳仪。
7.5 凝胶成像系统。
7.6 电子分析天平：精度0.01 g。
7.7 涡旋混匀仪。
7.8 超净工作台。
7.9 恒温水浴锅：42 ℃。
7.10 超净工作台。
7.11 恒温培养箱：37 ℃。
7.12 恒温水平摇床：37 ℃。
7.13 高压灭菌锅。
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8 操作步骤
8.1 靶基因启动子序列查找
在相应物种的基因组数据库中查询靶基因的序列信息，确定其5’ UTR序列和转录起始位点。选取转录起始位点上游2000 bp的DNA序列作为靶基因的启动子序列。
注 1：拟南芥基因组数据库TAIR：https://www.arabidopsis.org/。
注 2：水稻基因组数据库RAP-DB：https://rapdb.dna.affrc.go.jp/。
8.2 靶位点设计
利用在线CRISPR/Cas9靶位点设计工具辅助设计靶位点。本文件以CRISPR-GE网站为例。点击进入该网站“targetDesign”模块，“PAM type”设定为“SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5’-NGG-3’”，“Target site length (nt)”设定为“20”，并在“Target (reference) genome”选择相应的物种基因组。在“Sequence submission”对话框中输入8.1中靶基因转录起始位点上游200 bp的DNA序列，点击“Submit”提交。根据网站返回的结果，舍弃带有“Bad site warning”标记或“off-score”大于0.6的靶位点，选择“off-score”最小的4~6个靶位点作为候选靶位点。
注：在线靶位点设计工具CRISPR-GE：http://skl.scau.edu.cn/。
8.3 sgRNA表达框构建
sgRNA表达框由U6启动子、靶序列、sgRNA骨架和TTTTTT转录终止信号4个元件构成。利用重叠PCR方法构建sgRNA表达框，其原理示意图如图1所示。
图1 重叠PCR构建sgRNA表达框原理示意图
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8.3.1 引物设计
根据8.2所选靶序列设计重叠PCR引物，引物序列如表1所示。
表 1 重叠PCR引物
引物名称
引物序列（从5’到3’）
F1
CGAGGCGCGCCCTTTTTTTCTTCTTCTTCG（适用于双子叶植物）
CGAGGCGCGCCGGTACCTTTTTTCCTGTAGTTTTCC（适用于单子叶植物）
R1
N’20(C)AATCACTACTTCGACTCTAG（适用于双子叶植物）a
N’20(C)GGCAGCCAAGCCAGCACCC（适用于单子叶植物）a
F2
N20GTTTTAGAGCTAGAAATAGb
R2
CGAGGCGCGCCAAAAAAGCACCGACTCGGTG
注 1：表达sgRNA所使用的U6启动子因植物种类不同而不同，双子叶植物使用拟南芥AtU6_26启动子，单子叶植物使用水稻OsU6a启动子。相应地，重叠PCR须使用不同的引物F1和引物R1。
注 2：引物加灭菌超纯水稀释至10 μM。
a 引物R1中“N’20”代表8.2中所选的靶序列的反向互补序列。如果靶序列的第一个碱基不是“G”，须在引物R1中“N’20”3’端额外添加一个“C”碱基，使得sgRNA序列以“G”起始。
b 引物F2中“N20”代表8.2中所选的靶序列。
8.3.2 第一轮PCR反应
对于双子叶植物，使用pUC119-AtU6_26-sgRNA质粒作为扩增模板；对于单子叶植物，使用pUC119-OsU6a-sgRNA质粒作为扩增模板。使用引物F1和R1扩增得到产物1，片段长度为418 bp（双子叶植物）或483 bp（单子叶植物）；使用引物F2和R2扩增得到产物2，片段长度为113 bp。使用Q5 高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系为25 μL，其中包含模板质粒10 ng，10 μM上游引物和下游引物各1.25 μL，10 mM dNTP混合物0.5 μL，5×Q5反应缓冲液5 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL，最后补加灭菌超纯水至25 μL。反应程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，60 ℃褪火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；72 ℃延伸2 min。
注：可使用具有相同效果的商品化DNA聚合酶进行PCR扩增。
8.3.3 第一轮PCR产物的纯化
配制1.2%琼脂糖凝胶，取2.5 μL 10×DNA上样缓冲液加入第一轮PCR产物中，混匀，在1×TAE缓冲液中以5V/cm恒压进行凝胶电泳20 min，在凝胶成像系统中观察目的条带。切取大小符合预期的条带，使用商品化胶回收和PCR产物纯化试剂盒按使用说明纯化第一轮PCR产物，最后加入30 μL灭菌超纯水溶解。按照GB/T 34796测定DNA浓度，并加入适量灭菌超纯水稀释至10 ng/μL。
8.3.4 第二轮PCR反应
使用纯化所得第一轮PCR产物1和产物2作为扩增模板。使用引物F1和R2扩增得到终产物，即带有特定靶序列的sgRNA表达框，片段长度为511 bp（双子叶植物）或576 bp
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（单子叶植物）。使用Q5 高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系为50 μL，其中包含产物1和产物2各5 ng，10 μM引物F1和引物R2各2.5 μL，10 mM dNTP混合物1 μL，5×Q5反应缓冲液10 μL，Q5 DNA聚合酶0.5 μL，最后补加灭菌超纯水至50 μL。反应程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，60 ℃褪火30 s，72 ℃延伸20 s，30个循环；72 ℃延伸2 min。
注：可使用具有相同效果的商品化DNA聚合酶进行PCR扩增。
8.3.5 第二轮PCR产物的纯化
配制1.2%琼脂糖凝胶，取5 μL 10×DNA上样缓冲液加入第二轮PCR产物中，混匀，在1×TAE缓冲液中以5V/cm恒压进行凝胶电泳20 min，在凝胶成像系统中观察目的条带。切取大小符合预期的条带，使用商品化胶回收和PCR产物纯化试剂盒按使用说明纯化第二轮PCR产物，最后加入50 μL灭菌超纯水溶解。
8.4 限制性内切酶消化sgRNA片段
利用限制性内切酶AscI消化sgRNA片段，产生黏性末端，酶切反应体系为50 μL，其中包含8.3.5纯化所得sgRNA片段44 μL，AscI限制性内切酶1 μL，10×酶切反应缓冲液5 μL。37 ℃反应2 h后，使用商品化胶回收和PCR产物纯化试剂盒按使用说明纯化sgRNA片段，最后加入15 μL灭菌超纯水溶解，并按照GB/T 34796测定DNA浓度。
8.5 克隆载体的线性化
利用限制性内切酶AscI消化克隆载体，使其线性化。对于双子叶植物，使用pFGC-dCas9-TV质粒作为载体；对于单子叶植物，使用pCAMBIA-dCas9-TV质粒作为载体。酶切反应体系为50 μL，其中包含载体质粒1 μg，AscI限制性内切酶1 μL，10×酶切反应缓冲液5 μL，最后补加灭菌超纯水至50 μL，37 ℃反应12 h。随后加入0.5 μL CIAP，混匀，37 ℃反应1 h，进行去磷酸化。配制0.6%琼脂糖凝胶，取5 μL 10×DNA上样缓冲液加入反应体系中，混匀，在1×TAE缓冲液中以5V/cm恒压进行凝胶电泳30 min，在凝胶成像系统中观察目的条带。pFGC-dCas9-TV载体大小为14.7 kb，pCAMBIA-dCas9-TV载体大小为16.2 kb。切取载体条带，使用商品化胶回收和PCR产物纯化试剂盒按使用说明纯化线性化的载体，最后加入15 μL灭菌超纯水溶解，并按照GB/T 34796测定DNA浓度。
注：pFGC-dCas9-TV质粒和pCAMBIA-dCas9-TV质粒均含有人工转录激活因子dCas9-TV的组成型表达框，前者含有草铵膦抗性基因，后者含有潮霉素抗性基因。
8.6 sgRNA片段与线性化载体的连接
利用T4 DNA连接酶连接sgRNA片段与线性化载体，反应体系为10 μL，其中包含sgRNA片段20 ng，线性化载体60 ng，10×T4 DNA连接酶反应缓冲液1 μL，T4 DNA连接酶0.3 μL，最后补加灭菌超纯水至10 μL，在16 ℃下反应12 h。
8.7 连接产物转化
将大肠杆菌DH5α化学感受态细胞置于冰上融化，在超净工作台中，向100 μL感受态
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细胞中迅速加入10 μL连接产物，轻弹离心管数下混匀，冰上放置30 min。将离心管置于42 ℃恒温水浴锅中热击45 s，然后快速转移到冰上，放置2 min，注意不要摇动离心管。向离心管中加入900 μL无抗生素的LB液体培养基，在37 ℃摇床中以220 rpm转速振荡培养1 h，使菌体复苏。使用离心机以转速8000 g离心1 min，吸去900 μL上清，用移液枪轻轻吹打以重悬菌体，随后将菌液涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，在37 °C恒温培养箱中倒置培养16 h。
8.8 质粒提取
随机挑取8个单菌落，分别接种于5 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37 ℃摇床中以220 rpm转速培养12 h。使用离心机以转速12000 g离心30 s，分多次把菌体收集至1.5 mL离心管中。按照GB/T 40170中规定的方法或使用具相同效果的商品化质粒DNA提取试剂盒提取重组质粒，随后按照GB/T 34796测定质粒浓度。
8.9 限制性内切酶酶切反应分析
利用限制性内切酶AscI酶切反应分析所得重组质粒的正确性，反应体系为20 μL，其中包含重组质粒800 ng，AscI限制性内切酶0.4 μL，10×酶切反应缓冲液2 μL，最后补加灭菌超纯水至20 μL，37 ℃反应2 h。配制1.0%琼脂糖凝胶，取2 μL 10×DNA上样缓冲液加入酶切产物中，混匀，在1×TAE缓冲液中以5V/cm恒压进行凝胶电泳20 min，在凝胶成像系统中观察酶切产物。正确的重组质粒应产生497 bp（pFGC-dCas9-TV载体）或者562 bp（pCAMBIA-dCas9-TV载体）的条带。
8.10 Sanger测序验证
通过Sanger测序验证重组质粒的正确性。pFGC-dCas9-TV载体使用引物pFGC-F（序列为5’- CTTACGTCACGTCTTGCGC -3’）进行测序，pCAMBIA-dCas9-TV载体使用引物M13-R（序列为5’- CAGGAAACAGCTATGAC -3’）进行测序。经测序验证序列符合预期的重组质粒即为最终所得CRISPR/Cas9靶向基因转录激活载体，可用于植物瞬时表达和稳定遗传转化。
注：sgRNA片段插入载体的方向不影响转录激活效果。