GB 31615.2-2025 食品安全国家标准 食品用菌种安全性评价程序

中华人民共和国国家标准
GB31615.2—2025
食品安全国家标准
食品用菌种安全性评价程序
2025-03-16发布2026-03-16实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国家市场监督管理总局发布
食品安全国家标准
食品用菌种安全性评价程序
1 范围
本标准规定了食品用菌种(包括细菌、放线菌、丝状真菌、酵母及单细胞藻类)的安全性评价程序。
本标准适用于食品、食品添加剂用活的微生物菌种(包括细菌、放线菌、丝状真菌、酵母及单细胞藻
类)的安全性评价。
本标准不适用于遗传修饰微生物的安全性评价。
2 术语和定义
2.1 致病性
微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力。
2.2 产毒能力
微生物产生对生物体有损伤作用物质的能力。
2.3 毒性
微生物有毒代谢产物引起的宿主健康损伤。
2.4 抗菌药物耐药性
微生物对抗菌药物的抗性,耐药性又分为固有耐药(又称天然耐药)和获得性耐药两类。
2.5 固有耐药性
微生物对抗菌药物的天然耐药,反映了1个种内所有或几乎所有野生型菌株的抗菌模式。一种由
微生物基因组基因决定且代代相传、不依赖于基因的水平转移或染色体定位基因的自发突变且不随着
物种的系统发育进化而消失或出现的特性,与抗菌药物的存在无关。
2.6 获得性耐药
当微生物接触抗菌药物后,原来敏感的微生物发生基因突变或获得外源性耐药基因而改变自身的
代谢途径,使其能避免被药物抑制或杀灭。可由水平转移元件(如质粒、转座子、整合子等)介导,或由染
色体突变引起。
2.7 最低抑菌浓度
在规定的体外试验条件下、规定的时间内,可观察到抑制微生物生长的最低药物浓度(minimum
inhibitoryconcentration,MIC)。
2.8 全基因组测序
在1次测序中确定1个生物体DNA 序列(包括生物体的全部染色体、质粒、线粒体以及植物叶绿
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体等)的操作过程。
2.9 诱变
通过物理方法、化学诱变剂、生物因子诱发生物体遗传物质发生1个或多个突变的过程,其变种的
发生频率显著高于自发突变。
3 拟评价微生物菌种的基本资料
3.1 基本信息
包括菌种名称(包括中文名、拉丁名、别名等)、来源及用途。
3.2 分类学资料
包括规范、科学的菌种分类学(属、种、亚种等)资料。当菌种分类学地位发生变化时,还应包含其重
新分类后的名称及曾用名。
3.3 鉴定资料
包括基于表型和基因型的菌种鉴定资料。
3.4 生长环境条件资料
包括适宜于菌种生长的培养基及培养条件(包括但不限于培养时间、培养温度和湿度、需氧情况、光
照等),以及菌种的保藏及复壮方法等。
3.5 诱变菌种的资料
经诱变的菌种,应包括其详细的诱变方法(包括使用的诱变剂、诱变条件及诱变试验流程等),以及
诱变后其表型和基因型等发生的变化。
3.6 遗传稳定性资料
包括1个生产周期内最多传代次数2倍以上代数的菌种关键指标或特征的遗传稳定性资料。
3.7 生产相关信息
包括但不限于菌种用于食品、食品添加剂等生产的原辅料记录、产品配方、工艺流程、技术要求或企
业标准等资料。
3.8 其他资料
需要说明的其他技术资料。
4 评价方法
在掌握3.1~3.8所列资料基础上,对微生物菌种按照以下方法开展安全性评价:
a) 国内外安全性评价资料分析:对菌种国内、国外使用历史及安全性(包括但不限于其致病性和
产毒能力报告、临床试验资料、科技文献或综述等)进行综合分析。若无上述资料,应对同种内
其他株或在亲缘关系上与其相近种属菌种的使用历史和安全性评价资料(包括但不限于与该
菌种的亲缘性关系说明、基因序列匹配度分析等)进行分析。
b) 全基因组测序:对菌种进行全基因组测序,分别获得其基因组框架图和完成图(藻类除外),并
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对测序数据的毒力基因、耐药基因、毒素产生相关基因等进行综合分析。
c) 动物致病性试验:分别参照附录A~附录D的方法或其他等效方法进行动物致病性试验,并
对试验结果进行评价。
d) 耐药性试验:参照附录E中的方法或其他等效方法,对细菌菌种进行耐药性试验,同时结合全基
因组测序获得的基因组完成图中耐药基因携带情况,进行综合评价。
e) 产毒试验:对细菌菌种,应对其基因组中产毒基因携带及表达情况进行综合分析与评价。若携
带产毒基因且能表达,应参照生产条件进行包括生产用培养基在内的多种基质中(单品种固
体、多品种固体复合、不同成分液体组合等)的产毒试验。产毒试验的培养时间应不短于1个
产品生产周期,并按照食品安全国家标准规定的检验方法或其他等效方法进行毒素(或抗菌物
质)含量(或活性)检测。
对真菌菌种,其产毒试验应参照附录F中的方法进行,并按照食品安全国家标准规定的检验
方法或其他等效方法进行真菌毒素含量的测定。
放线菌产生的抗菌物质或藻类产生的藻类毒素应按照相应食品安全国家标准规定的检验方法
或其他等效方法进行检验。
若产毒试验显示受试菌种产生毒素(或抗菌物质),则应根据产生毒素(或抗菌物质)的水平,并
结合人群对用该菌种生产食品的摄入量,评估其对人群健康的影响。
f) 毒理学试验:对国内外均无食用习惯的菌种,应进行急性经口毒性试验/致病性试验、3项遗传
毒性试验、90天经口毒性试验、致畸试验和生殖毒性试验。仅在国外个别国家或国内局部地
区有食用习惯的菌种,应进行急性经口毒性试验/致病性试验、3项遗传毒性试验、90天经口毒
性试验;已在多个国家批准食用的菌种,可进行急性经口毒性试验/致病性试验、2项遗传毒性
试验。其中,2项遗传毒性试验包括细菌回复突变试验和哺乳动物红细胞微核试验,3项遗传
毒性试验按照GB15193.1《食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序》中规定的遗传
毒性试验组合进行。
g) 其他活性物质测定:直接添加到供1岁以下婴儿食用食品中的菌种,还应按照食品安全国家标
准规定的检验方法或其他等效方法进行D-乳酸的测定。
具有溶血活性或可产生其他代谢产物的菌种,还应按照食品安全国家标准规定的检验方法或
其他等效方法进行溶血活性物质或相关代谢产物的测定。
5 结果判定
5.1 致病性及产毒能力完全符合以下3种情况者认为该菌种是安全的:
a) 全基因组序列分析结果显示不存在已知的毒力/致病相关基因或毒素合成关键基因;或存在可
能与致病相关的基因,但根据菌种的功能特性及文献资料排除该基因与宿主致病相关。
b) 动物试验显示无致病性。
c) 产毒试验结果显示在受试的所有基质中均不产生已知的、危害人类健康的活性代谢产物。
5.2 全基因组序列中发现含有已知毒力/致病基因或毒素合成关键基因,但动物试验显示不具有致病
性,或产毒试验显示在受试的培养基中可产生已知的有毒活性代谢产物但水平较低,评估结果表明长期
摄入对人体健康无影响,结合国内外安全使用历史,可认为该菌种是安全的。
5.3 全基因组测序结果显示存在已知毒力/致病或毒素合成关键基因,且动物试验显示具有致病性或
产生高水平已知的有毒代谢产物,长期摄入可能影响人体健康,认为该菌种是不安全的。
5.4 以下耐药性的判定原则仅适用于5.1及5.2中已确认为安全的细菌菌种:
a) 对受试抗菌药物无耐药性,表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的MIC值低于设定的阈
值,且全基因组序列中未检测到与耐药表型直接相关的耐药基因,或检测到与耐药表型直接相
关的耐药基因但经试验证实其不介导耐药,则认为该菌种是安全的。
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b) 对受试抗菌药物具有固有耐药性,表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的MIC值高于设定
的阈值,且其携带的耐药基因位于染色体上,通过水平传播的可能性很小,认为该菌种是安
全的。
c) 对受试抗菌药物产生获得性耐药,表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的MIC值高于设定
的阈值,若产生耐药的机制是染色体突变所致,其水平传播的可能性很低,一般认为该菌种是
安全的。
d) 菌种对1种或几种抗菌药物的MIC值高于设定的阈值,若全基因组测序分析结果显示耐药决
定子位于可移动遗传元件上,具有水平传播的潜力,则认为该菌种是不安全的。
e) 若该菌种基因组中存在对世界卫生组织关于人类医学至关重要抗菌药物和高度重要抗菌药物
列表中规定的抗生素耐药基因,则应结合其MIC值进行综合判定:
———若MIC值高于设定的阈值,则认为该菌种是不安全的;
———若MIC值低于设定的阈值,则应评估该耐药基因表达的可能性,若能表达,则认为该菌种
是不安全的。
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附 录 A
食品用细菌致病性试验方法
A.1 范围
本方法规定了食品用细菌的致病性试验方法。
本方法适用于食品用细菌的致病性评价。
A.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备与材料如下。
A.2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
A.2.2 离心机:离心力≥3000g。
A.2.3 电子天平:感量分别为0.1g和0.001g。
A.2.4 比浊仪。
A.2.5 温湿度计。温度计允许误差:±1℃,湿度计允许误差:±3% RH。
A.2.6 显微镜:10×~100×。
A.2.7 厌氧培养装置:厌氧罐(袋、盒等)或厌氧培养箱。
A.2.8 无菌锥形瓶:容量100mL、500mL。
A.2.9 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
A.2.10 无菌试管:16mm×160mm。
A.2.11 无菌培养皿:直径90mm。
A.2.12 无菌量筒:容量100mL。
A.2.13 微量移液器及配套吸头:量程为100μL~1000μL 。
A.2.14 注射器:量程为100μL~1000μL 。
A.2.15 小鼠灌胃针头。
A.2.16 无菌微孔滤膜:孔径0.22μm。
A.3 培养基和试剂
A.3.1 无菌生理盐水:0.85%的商品化生理盐水或8.5gNaCl溶于1000mL蒸馏水中,分装后121℃
高压灭菌15min,备用。
A.3.2 LB(Luria-Bertan,LB)肉汤培养基:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解
后分装,121℃高压灭菌15min,备用。
A.3.3 LB琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121 ℃高压
灭菌15min,制备LB琼脂平板,备用。
A.3.4 半胱氨酸盐酸盐储备液:称取500mg半胱氨酸盐酸盐于50mL无菌离心管中,加入10mL蒸
馏水,充分溶解后用0.22μm 无菌微孔滤膜过滤除菌,备用。
A.3.5 含有半胱氨酸盐酸盐的MRS(ManRogosaSharpe)肉汤培养基:商品化MRS肉汤培养基按照产品
说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15min,待培养基冷却至50℃左右时,加入
A.3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储备液,使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL,备用。
A.3.6 含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板:商品化的MRS琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水
配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15min,待培养基冷却至50 ℃左右时,加入A.3.4中制备
的半胱氨酸盐酸盐储备液,使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL,制备含有半胱氨酸盐
酸盐的MRS琼脂平板,备用。
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A.3.7 含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板:商品化的双歧杆菌琼脂培养基按照产品说明书用蒸
馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15min,待培养基冷却至50 ℃左右时,加入A.3.4中
制备的半胱氨酸盐酸盐储备液,使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL,制备含有半胱氨酸盐酸盐
的双歧杆菌琼脂平板,备用。
A.4 实验动物
选用SPF级昆明或ICR健康成年小鼠,雌雄各半,体重范围为18.0g~22.0g。动物质量、实验室
管理、试验条件等符合GB/T35823《实验动物 动物实验通用要求》的规定。
A.5 操作步骤
对于国内外均无使用历史的菌种,或国内外虽有使用历史,但对人和动物健康有不良影响记载或报
道的菌种,必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物,以评价受试物不同给予途径对动物
的致病性。
对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种,可选择经口灌胃
单一途径给予动物受试物,以评价受试物对动物的致病性。
A.5.1 腹腔注射
A.5.1.1 菌种活化:目前我国食品用细菌菌种主要是双歧杆菌属、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌
属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属等,除这些属以外,其他菌种在以下描述中均使用“其他细
菌”。根据送检菌种的保存状态,将双歧杆菌、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合
乳杆菌属、广布乳杆菌属接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS肉汤培养基、其他细菌接种LB肉汤培养基
(或适于该菌生长的最适液体培养基中)活化(或传代使活力达到最佳),并置适宜的培养条件(包括培养
温度、湿度、厌氧、需氧、微需氧等)下培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异),确认为纯培养后
备用。
A.5.1.2 菌悬液制备:将A.5.1.1中活化的双歧杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板或含有
半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板;乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌
属、广布乳杆菌属接种含有半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板,其他细菌接种LB琼脂平板或适应于该
菌生长的最适培养基琼脂平板,在规定的适宜培养条件(包括培养温度、湿度、厌氧、有氧、微需氧等)下
培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)后,刮取平板上的菌落,将其悬浮于无菌生理盐水中,充
分混匀后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浊度,使最终菌悬液中的菌浓度为5.0×107 CFU/mL,用于
小鼠腹腔注射。
A.5.1.3 腹腔注射:小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠无菌生
理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组。注射量为0.2mL/只,
即受试物组每只小鼠注射菌量至少1.0×107 CFU。
A.5.1.4 动物观察:动物腹腔注射后每天观察1次,连续观察至少21d。观察并记录小鼠皮肤和毛、眼
睛和黏膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。特别注意观察是否出现震颤、抽搐、腹泻、嗜睡、
流涎和昏迷等现象。试验前称量并记录所有小鼠的体重,试验结束后称量并记录所有存活小鼠的体重。
对于试验期间死亡的小鼠,尽可能精确记录小鼠的死亡时间,同时称重并记录。
A.5.2 经口灌胃
A.5.2.1 菌数预估
无菌吸取A.5.1.1的培养液,分别加至2个无菌离心管中,每管1mL,3000g 离心10min,弃去上清
液后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浊度,使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5×108 CFU/mL和
1.25×109 CFU/mL,并分别记录每毫升培养液离心后所得沉淀物中细菌数调整至2.5×108 CFU/mL
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和1.25×109 CFU/mL时需加入的无菌生理盐水的体积(mL)。
A.5.2.2 菌悬液制备
A.5.2.2.1 培养上清液的制备:根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌种培养
液用量,吸取A.5.1.1培养液,将培养液一分为二,3000g 各离心10min后,将上清液分别转至100mL
无菌量筒中,1份上清液用于菌悬液原液的制备,另1份上清液冷冻浓缩至原体积的1/5,作为5倍浓缩
上清液,备用。
A.5.2.2.2 菌悬液原液的制备:按照A.5.2.1中获得的细菌终浓度达到2.5×108 CFU/mL所需要的生
理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入A.5.2.2.1获得的上清液,调整离心后的沉淀物使
其细菌数达到2.5×108 CFU/mL(上清液量不够时可用空白培养基补齐)。
A.5.2.2.3 5倍浓缩菌悬液的制备:按照A.5.2.1中获得的细菌终浓度达到1.25×109 CFU/mL所需要
的生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入A.5.2.2.1获得的5倍浓缩上清液,调整离心
后的沉淀物使其细菌数达到1.25×109 CFU/mL。
A.5.2.3 灌胃
小鼠不少于80只,雌雄各半,随机分成8组(每组不少于10只),包括雄性小鼠培养基对照组、雄性
小鼠菌悬液组、雄性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠5倍浓缩菌悬液组、雌性小鼠培养基对照组、
雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雌性小鼠5倍浓缩菌悬液组。各组均以20mL/kg
体重的体积给小鼠灌胃,使受试物组每只小鼠灌胃菌量分别为1.0×108 CFU(原液组)和5.0×108 CFU
(5倍浓缩液组),连续灌胃3d。首次灌胃前动物禁食过夜(16h),灌胃后3h~4h喂食。
A.5.2.4 观察
动物经口灌胃后每天观察1次,至少连续观察21d,观察指标同A.5.1.4。
A.6 结果与报告
对A.5.1和A.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价,包括:
a) 受试物对动物一般健康情况有无不良影响;
b) 受试物对动物体重等指标的影响;
c) 受试物组动物死亡情况;
d) 对受试物组和相应对照组小鼠的体重分别进行独立样本t 检验,检验标准为α=0.05。若受试
物组动物在试验期间未出现中毒症状或死亡,且体重等指标与对照组相比差异无统计学意义,
即可判定该菌种无致病性;若受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡,或试验期间体重
等指标与对照组相比有显著性差异,即可判定该菌种具有致病性。
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GB31615.2—2025
附 录 B
食品用丝状真菌的致病性试验方法
B.1 范围
本方法规定了食品用丝状真菌的致病性试验方法。
本方法适用于食品用丝状真菌的致病性评价。
B.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备和材料如下。
B.2.1 恒温培养箱:28℃±1℃。
B.2.2 电子天平:感量为0.1g。
B.2.3 锥形瓶:容量为500mL。
B.2.4 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
B.2.5 显微镜:10×~100×。
B.2.6 微量移液器及配套吸头:量程为100μL~1000μL 。
B.2.7 血球计数板。
B.2.8 注射器:量程为100μL~1000μL。
B.2.9 小鼠灌胃针头。
B.2.10 温湿度计。温度计允许误差:±1℃,湿度计允许误差:±3% RH。
B.2.11 接种钩。
B.2.12 球磨仪或功能相当的仪器。
B.2.13 无菌培养皿:直径90mm。
B.3 培养基和试剂
B.3.1 无菌生理盐水:见A.3.1。
B.3.2 麦芽汁琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121 ℃高
压灭菌15min,制备麦芽汁琼脂平板,备用。
B.3.3 马铃薯葡萄糖琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,
121℃高压灭菌15min,制备马铃薯葡萄糖琼脂平板,备用。
如菌种在上述2种培养基上的生长状态和产孢子量均不理想,可选用适于该菌种生长和产孢的其
他培养基。
B.4 实验动物
见A.4。
B.5 操作步骤
对于国内外均无使用历史的菌种,或国内外虽有使用历史,但对人和动物健康有不良影响记载或报
道的菌种,必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物,以评价受试物不同给予途径对动物
的致病性。
对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种,可选择经口灌胃
单一途径给予动物受试物,以评价受试物对动物的致病性。
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GB31615.2—2025
B.5.1 腹腔注射
B.5.1.1 菌种活化
将送检菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板(红曲霉接种于麦芽汁琼脂平板)或适于该菌生长的最适
培养基中,并置于适宜的培养条件下(包括培养温度、湿度、光照、通气量等)培养一定时间(培养时间长
短视不同菌种而异),确认为纯培养后备用。
B.5.1.2 菌悬液制备
B.5.1.2.1 产孢子量大的菌种:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板(红曲霉属菌种接种麦芽汁琼脂
平板)或适于菌种生长的培养基平板,28℃±1℃培养7d~14d后,挑取平板上的孢子,将其悬浮于无
菌生理盐水中,充分混匀后,用血球计数板计数孢子浓度,并用适量无菌生理盐水调整,使其最终浓度不
低于5.0×107 CFU/mL。
B.5.1.2.2 产孢子量少或不产孢子的菌种:将菌种接种于适宜的培养基上,28 ℃±1 ℃下培养7d~
14d或在适宜的诱导产孢条件下培养一定时间后,挑取平板上的菌丝体及孢子,用球磨仪(或其他功能
相当的仪器)将菌丝体磨碎,并用生理盐水重悬后,用血球计数板计数,并用适量无菌生理盐水调整,使
菌悬液中菌丝体片段数/孢子的最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL。
B.5.1.3 腹腔注射
小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄
性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组,每只小鼠注射0.2mL,即受试物组每
只小鼠注射的菌量至少为1.0×107 CFU。
B.5.1.4 动物观察
动物腹腔注射后每天观察1次,至少连续观察21d,观察指标同A.5.1.4。
B.5.2 经口灌胃
B.5.2.1 菌悬液制备:除制备的菌悬液中真菌孢子/菌丝体片段的浓度不低于2.5×108CFU/mL外,其
他操作步骤同B.5.1.2。
B.5.2.2 灌胃:小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠生理盐水对
照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组,各组均以20mL/kg体重的体积
给小鼠灌胃1次,使受试物组每只小鼠灌胃菌量为1.0×108 CFU,灌胃前禁食过夜(16h),灌胃后3h~4h
喂食。
B.5.2.3 观察:动物经口灌胃后每天观察1次,至少连续观察21d,观察指标同A.5.1.4。
B.6 结果与报告
对B.5.1和B.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价,内容同A.6。
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GB31615.2—2025
附 录 C
食品用酵母的致病性试验方法
C.1 范围
本方法规定了食品用酵母的致病性试验方法。
本方法适用于食品用酵母的致病性评价。
C.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备和材料如下:
C.2.1 恒温培养箱:28℃±1℃。
C.2.2 电子天平:感量为0.1g。
C.2.3 锥形瓶:容量为500mL。
C.2.4 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
C.2.5 显微镜:10×~100×。
C.2.6 微量移液器及配套吸头:量程为100μL~1000μL 。
C.2.7 血球计数板。
C.2.8 注射器:量程为100μL~1000μL。
C.2.9 小鼠灌胃针头。
C.2.10 温湿度计。温度计允许误差:±1℃,湿度计允许误差:±3% RH。
C.2.11 接种环。
C.2.12 离心机:离心力≥3000g。
C.2.13 无菌培养皿:直径90mm。
C.2.14 无菌量筒:容量100mL。
C.3 培养基和试剂
C.3.1 无菌生理盐水:见A.3.1。
C.3.2 麦芽汁琼脂平板:见B.3.2。
C.3.3 麦芽汁培养基:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121 ℃高压
灭菌15min,备用。
如菌种在麦芽汁琼脂培养基上的生长状态不理想,可选用适于该菌种生长的其他培养基。
C.4 实验动物
见A.4。
C.5 操作步骤
对于国内外均无使用历史的菌种,或国内外虽有使用历史,但对人和动物健康有不良影响记载或报
道的菌种,必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物,以评价受试物不同给予途径对动物
的致病性。
对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种,可选择经口灌胃
单一途径给予动物受试物,以评价受试物对动物的致病性。
C.5.1 腹腔注射
C.5.1.1 菌种活化:根据送检菌种的保存状态,接种于麦芽汁琼脂平板或适于该菌生长的最适液体培
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GB31615.2—2025
养基中,并置于适宜的培养条件(包括培养温度、湿度、通气量等)下培养一定时间(培养时间长短视不同
菌种而异),确认为纯培养后备用。
C.5.1.2 菌悬液制备:将菌种接种麦芽汁琼脂平板,28℃±1℃培养一定时间(培养时间长短视不同菌
种而异)后,刮取平板上的菌落,将其悬浮于无菌生理盐水中,充分混匀后,用血球计数板计数,并用适量
无菌生理盐水调整菌悬液浓度,使菌悬液中菌的最终浓度不低于5.0×107 CFU/mL。
C.5.1.3 腹腔注射:小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠生理
盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组及雌性小鼠菌悬液组,每只小鼠腹腔注射0.2
mL,即每只小鼠注射的菌量不少于1.0×107 CFU。
C.5.1.4 动物观察:动物腹腔注射后每天观察1次,至少连续观察21d,观察指标同A.5.1.4。
C.5.2 经口灌胃
C.5.2.1 菌种培养
将菌种接种到麦芽汁培养基中,28 ℃±1 ℃培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)后,
备用。
C.5.2.2 菌数预估
无菌吸取C.5.2.1的培养液,分别加至2个无菌离心管中,每管1mL,3000g 离心10min,弃去上清液
后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浓度并计数,使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5×108 CFU/mL
和6.25×108 CFU/mL,并分别记录每毫升培养液离心后所得沉淀物中酵母菌数调整至2.5×108 CFU/mL
和6.25×108 CFU/mL时加入无菌生理盐水的体积(mL)。
C.5.2.3 菌悬液制备
C.5.2.3.1 培养上清液的制备:根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌种培养液
用量,继而将培养液一分为二,3000g 各离心10min后,将上清液分别转至100mL无菌量筒中,1份上清
液作为菌悬液原液的制备,另1份上清液冷冻浓缩至原体积的2/5,作为2.5倍浓缩上清液,备用。
C.5.2.3.2 菌悬液原液的制备:按照C.5.2.2中获得的酵母菌终浓度达到2.5×108 CFU/mL所需要的
生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入C.5.2.2获得的上清液,调整离心后的沉淀物
使其酵母菌数达到2.5×108 CFU/mL(上清液量不够时可用空白培养基补齐)。
C.5.2.3.3 浓缩菌悬液的制备:按照C.5.2.2中获得的酵母菌终浓度达到6.25×108 CFU/mL所需要的
生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入C.5.2.2获得的培养上清液2.5倍浓缩液,调整
离心后的沉淀物使其菌数达到6.25×108 CFU/mL。
C.5.2.4 灌胃
小鼠不少于80只,雌雄各半,随机分成8组(每组不少于10只),包括雄性小鼠培养基对照组、雄性
小鼠菌悬液组、雄性小鼠2.5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠2.5倍浓缩菌悬液组、雌性小鼠培养基对照
组、雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠2.5倍浓缩培养基对照组、雌性小鼠2.5倍浓缩菌悬液组。各组均以
20mL/kg体重的体积给小鼠灌胃1次,使受试物组每只小鼠灌胃菌量分别为1.0×108 CFU(原液组)
和2.5×108 CFU(2.5倍浓缩液组),灌胃前应禁食过夜(16h),灌胃后3h~4h喂食。
C.5.2.5 观察
动物经口灌胃后每天观察1次,至少连续观察21d,观察指标同A.5.1.4。
C.6 结果与报告
对C.5.1和C.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价,内容同A.6。
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GB31615.2—2025
附 录 D
食品用放线菌的致病性试验方法
D.1 范围
本方法规定了食品用放线菌的致病性试验方法。
本方法适用于食品用放线菌的致病性评价。
D.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备与材料如下。
D.2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
D.2.2 离心机:离心力≥3000g。
D.2.3 电子天平:感量分别为0.1g和0.001g。
D.2.4 比浊仪。
D.2.5 温湿度计。温度计允许误差:±1℃,湿度计允许误差:±3% RH。
D.2.6 显微镜:10×~100×。
D.2.7 无菌锥形瓶:容量100mL、500mL。
D.2.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
D.2.9 无菌试管:16mm×160mm。
D.2.10 无菌培养皿:直径90mm。
D.2.11 无菌量筒:容量100mL。
D.2.12 微量移液器及配套吸头:量程100μL~1000μL。
D.2.13 注射器:量程100μL~1000μL。
D.2.14 小鼠灌胃针头。
D.3 培养基和试剂
D.3.1 葡萄糖天门冬素培养基:葡萄糖10g、天门冬素0.5g、K2HPO40.5g,加水至1000mL,调节
pH 至7.2~7.4,分装后121℃高压灭菌15min,备用。商品化葡萄糖天门冬素琼脂培养基按照产品说
明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15min,制备葡萄糖天门冬素平板,备用。
D.3.2 高氏1号培养基:可溶性淀粉20g、KNO31.0g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O0.5g、NaCl
0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、琼脂粉15.0g,加蒸馏水1000mL,调节pH 至7.2~7.4,分装后121℃高
压灭菌20min,备用。商品化高氏1号琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分
装,121℃高压灭菌20min,制备高氏1号平板,备用。
如菌种在葡萄糖天门冬素培养基或高氏1号培养基上的生长状态不理想,可选用适于该菌种生长
的其他培养基。
D.4 实验动物
见A.4。
D.5 操作步骤
对于国内外均无使用历史的菌种,或国内外虽有使用历史,但对人和动物健康有不良影响记载或报
道的菌种,必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物,以评价受试物不同给予途径对动物
的致病性。
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GB31615.2—2025
对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种,可选择经口灌胃
单一途径给予动物受试物,以评价受试物对动物的致病性。
D.5.1 腹腔注射
D.5.1.1 菌种活化:将放线菌菌种接种于葡萄糖天门冬素培养基或改良高氏1号培养基或适于该菌种
生长的其他培养基平板,并在适宜的培养条件下(包括培养温度、湿度、通气量等)培养一定时间(培养时
间长短视不同菌种而异),确认为纯培养后备用。
D.5.1.2 菌悬液制备:刮取D.5.1.1平板上的菌落,将其悬浮于无菌生理盐水中,充分混匀后,用适量无
菌生理盐水调整菌悬液浓度,使最终菌悬液中的菌浓度约为5.0×107 CFU/mL,用于小鼠腹腔注射。
D.5.1.3 腹腔注射:小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠无菌
生理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组。注射量为
0.2mL/只,即受试物组每只小鼠注射菌量至少1×107 CFU。
D.5.1.4 动物观察:动物腹腔注射后每天观察1次,连续观察至少21d。观察指标同A.5.1.4。
D.5.2 经口灌胃
D.5.2.1 菌数预估
同A.5.2.1。
D.5.2.2 菌悬液制备
D.5.2.2.1 培养上清液的制备:同A.5.2.2.1。
D.5.2.2.2 菌悬液原液的制备:同A.5.2.2.2。
D.5.2.2.3 5倍浓缩菌悬液的制备:同A.5.2.2.3。
D.5.2.3 灌胃
同A.5.2.3。
D.5.2.4 观察
同A.5.2.4。
D.6 结果与报告
对D.5.1和D.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价,内容同A.6。
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GB31615.2—2025
附 录 E
食品用细菌菌种抗菌药物耐药性的测定
(微量肉汤稀释法)
E.1 范围
本方法规定了食品用细菌菌种抗菌药物耐药性的测定方法。
本方法适用于食品用细菌菌种抗菌药物耐药性的测定。
E.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备与材料如下。
E.2.1 恒温培养箱:28℃±1℃、32℃±1℃和36℃±1℃。
E.2.2 厌氧培养装置:厌氧罐(袋、盒等)或厌氧培养箱。
E.2.3 比浊仪。
E.2.4 分光光度计:625nm。
E.2.5 恒温水浴:28℃~55℃。
E.2.6 pH 计:25℃下精度为±0.1。
E.2.7 电子天平:感量分别为0.1g和0.001g。
E.2.8 具盖(或塞)试剂瓶:容量分别为150mL、250mL、500mL、1000mL。
E.2.9 无菌吸管:量程分别为0.05mL(具0.001mL刻度)、0.1mL(具0.01mL刻度)、1.0mL(具0.01mL
刻度)、10mL(具0.1mL刻度),或同等量程的移液器及配套吸头。
E.2.10 无菌培养皿:直径90mm。
E.2.11 标准微孔板:96孔。
E.2.12 无菌滤膜:孔径0.22μm。
E.2.13 具盖(塞)无菌试管:10mL、20mL。
E.3 培养基和试剂
E.3.1 MRS琼脂培养基
蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、酵母提取物(浸粉)5.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、七水磷酸氢
二钾(K2HPO4·7H2O)2.0g、三水乙酸钠(NaCH3CO2·3H2O)5.0g,柠檬酸铵[(NH4)2HC6H5O7]
2.0g、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.1g、四水硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.05g、琼脂粉10.0g~15.0g
(视琼脂的凝胶强度可酌情增减琼脂粉的量),加入蒸馏水1000mL(当用于耐药性测定时,不加琼脂
粉,且加入蒸馏水的量为500mL),加热充分溶解后,调节pH 至6.4±0.1,分装后121℃高压灭菌15min。
于水浴中冷却至48℃后倾注平板,每板15mL~20mL,静置凝固后备用。制备好的平板可于塑料袋
中密封包装,2℃~8℃下避光保存,1周内使用完毕。
E.3.2 MRS-半胱氨酸琼脂(MRS-Cys琼脂)培养基
E.3.2.1 L-半胱氨酸储备液的配制:称取0.3gL-半胱氨酸盐酸盐,加入10mL蒸馏水中,充分溶解后
用0.22μm 滤膜过滤除菌,过滤除菌后的L-半胱氨酸储备液可于2 ℃~8 ℃下避光保存,1周内使用
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GB31615.2—2025
完毕。
E.3.2.2 MRS-Cys琼脂培养基平板制备:取E.3.1在水浴锅中冷却至48 ℃左右的MRS基础培养基
100mL,加入E.3.2.1中制备好的L-半胱氨酸储备液1mL,混匀后倾注平板,每板15mL~20mL,静置
凝固后备用。制备好的平板可密封包装于塑料袋中,于2℃~8℃下避光保存,1周内使用完毕。
E.3.3 M17-乳糖琼脂培养基
E.3.3.1 M17-基础培养基的配制:胰蛋白胨5.0g、大豆蛋白胨5.0g、牛肉粉5.0g、酵母提取物(浸粉)
2.5g、抗坏血酸(C6H8O6)0.5g、七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.25g、五水甘油磷酸钠(C3H7PO6Na2·
5H2O)19.0g、琼脂粉10.0g~15.0g(视琼脂的凝胶强度可酌情增减琼脂粉的量),加蒸馏水950mL,
加热溶解,调节pH 至7.4±0.1,分装后121℃高压灭菌15min,置于水浴中冷却至48℃备用。
E.3.3.2 乳糖储备液的配制:称取5.0g乳糖于50mL 蒸馏水中,充分溶解后用0.22μm 滤膜过滤
除菌。
E.3.3.3 M17-乳糖琼脂培养基的制备:取E.3.3.1中制备好的M17基础培养基95mL,加入E.3.3.2制
备好的乳糖储备液5mL,混匀(加入过程中避免气泡产生)后倾注平板,每板15mL~20mL,静置凝
固。制备好的平板可密封包装于塑料袋中,2℃~8℃下避光保存,2周内使用完毕。
E.3.4 Elliker琼脂培养基
胰酶消化的酪蛋白20.0g、酵母提取物(浸粉)5.0g、明胶2.5g、葡萄糖5.0g、乳糖5.0g、蔗糖5.0g、氯
化钠4.0g、三水乙酸钠(NaCH3CO2·3H2O)1.5g、抗坏血酸(C6H8O6)0.5g、琼脂粉10.0g~15.0g(视
琼脂的凝胶强度酌情增减加入琼脂粉的量),加入蒸馏水1000mL,加热溶解后,调节pH 至7.0±0.1,
分装后121℃高压灭菌15min,于水浴中冷却至48℃后倾注平板,每板15mL~20mL,静置凝固。制
备好的平板可密封包装于塑料袋中,2℃~8℃下避光保存,2周内使用完毕。
E.3.5 IST培养基
水解酪蛋白11.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠3.0g、可溶性淀粉1.0g、磷酸氢二钠2.0g、
乙酸钠1.0g、甘油磷酸镁0.2g、葡萄糖酸钙0.1g、硫酸钴0.001g、硫酸铜0.001g、硫酸锌0.001g、硫酸
铁0.001g、氯化镁0.002g、维生素K0.001g、维生素B120.001g、盐酸L-半胱氨酸0.02g、L-色氨酸
0.02g、维生素B60.003g、泛酸0.003g、烟碱0.003g、维生素H0.0003g、维生素B10.00004g、腺嘌呤
0.01g、鸟嘌呤0.01g、黄嘌呤0.01g、尿嘧啶0.01g,加入蒸馏水至1000mL(用于耐药性测定时,加入
蒸馏水至500mL),加热溶解后,调节pH 至7.6±0.1,分装后121 ℃高压灭菌15min。制备好的培养
基可密封后于2℃~8 ℃下避光保存,2周内使用完毕。对于1000mL 的IST 培养基中含量少于
0.001g的物质,可事先配制100倍~1000倍的浓缩液,继而按需要量换算成需要添加浓缩液的量。
E.3.6 IST乳糖培养基
无菌操作取E.3.5中制备好的IST培养基90mL,加入E.3.3.2制备好的乳糖储备液10mL,充分
混匀(当用于耐药性测定时,IST培养基制备时加入蒸馏水的体积减半)。制备好的培养基可密封后于
2℃~8℃下避光保存,2周内使用完毕。
E.3.7 LSM 培养基
取E.3.5中制备好的IST培养基90mL,加入E.3.1中制备好的不含琼脂粉的MRS培养基10mL,混
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GB31615.2—2025
匀。当用于耐药性测定时,IST培养基和不含琼脂粉的MRS培养基制备时均只加1/2体积的蒸馏水。
调节pH 至6.9±0.1,121℃高压灭菌15min。制备好的培养基可密封后于2 ℃~8 ℃下避光保存,
2周内使用完毕。
E.3.8 LSM-半胱氨酸培养基(LSM-Cys培养基)
取L-半胱氨酸盐酸盐0.03g,加至E.3.7中制备好的100mL未灭菌的LSM 培养基中,混匀至完全
溶解。当用于耐药性测定时,IST培养基和不含琼脂粉的MRS培养基制备时均只加1/2体积的蒸馏
水,调节pH 至6.9±0.1,121℃高压灭菌15min。制备好的培养基可密封后于2℃~8℃下避光保存,
1周内使用完毕。
E.3.9 CAMHB培养基
牛肉浸粉3.0g、酸水解酪蛋白17.5g、可溶性淀粉1.5g、氯化钙0.05g,加入蒸馏水1000mL(用于
耐药性测定时,加入蒸馏水的量为500mL),加热溶解后,调节pH 至7.5±0.1,分装后121℃高压灭菌
15min。制备好的培养基可密封后于2℃~8℃下避光保存,2周内使用完毕。
E.4 操作步骤
E.4.1 待测菌种的复苏及活化
E.4.1.1 冻干的菌种可按表E.1给定的培养基,在不含琼脂的相应液体培养基中复苏后再进行测定。
E.4.1.2 将待测菌种按表E.1的规定,在相应推荐的琼脂培养基和培养条件下活化。若菌种在推荐的
培养基和培养条件下生长状况不佳,则可添加其他适于该菌生长的碳源或改变培养条件,确保菌种生长
良好。
表E.1 推荐的培养条件
菌种名称培养基
培养温度
℃
培养条件
培养时间
h
双歧杆菌属MRS-半胱氨酸琼脂36±1 厌氧24~48
短乳杆菌MRS琼脂28±1 厌氧或兼性厌氧16~24
植物乳植杆菌/戊糖乳杆菌MRS琼脂28±1 厌氧或兼性厌氧16~24
清酒广布乳杆菌MRS琼脂28±1 厌氧或兼性厌氧16~24
德氏乳杆菌MRS琼脂36±1 厌氧或兼性厌氧16~24
其他与乳杆菌属培养条件相似的细菌MRS琼脂36±1 厌氧或兼性厌氧16~24
乳酸乳球菌M17-乳糖琼脂或
Elliker琼脂32±1 厌氧或兼性厌氧16~24
唾液链球菌嗜热亚种M17-乳糖琼脂或
Elliker琼脂36±1 厌氧或兼性厌氧16~24
屎肠球菌MRS琼脂36±1 需氧24~48
注1:短乳杆菌、植物乳植杆菌推荐的培养温度为28℃。由于同种内的不同株间对温度的要求会有差异,因此对
这2个种内某些株的培养温度可视情况适当调整。
注2:其他细菌可根据细菌本身特点选择适宜培养基、培养条件和培养时间。
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GB31615.2—2025
E.4.2 质控菌株
每次耐药性测定均需用标准菌株同步操作进行质量控制。
E.4.2.1 推荐使用的质控菌株包括植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum )ATCC14917、副干
酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ATCC334、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcuslactissubsp.
lactis)ATCC19435、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivariussubsp.thermophilus)LMG18311、
长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum )ATCC15707、粪肠球菌(Enterococcus
faecalis)ATCC29212。或其他等效菌株。
E.4.2.2 质控菌株的使用条件如下:
a) 待测乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属在28℃±
1℃条件下培养时,推荐用植物乳植杆菌ATCC14917或等效菌株作质控菌株。
b) 待测乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属在32℃±
1℃条件下培养时,推荐用乳酸乳球菌乳亚种ATCC19435或等效菌株作质控菌株。
c) 待测乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属在36℃±
1℃条件下培养时,推荐用副干酪乳酪杆菌ATCC334或等效菌株作质控菌株。
d) 对唾液链球菌嗜热亚种进行耐药性测定时,推荐用唾液链球菌嗜热亚种LMG18311或等效菌
株作质控菌株。
e) 对双歧杆菌进行耐药性测定时,推荐用长双歧杆菌长亚种ATCC15707或等效菌株作质控
菌株。
f) 对肠球菌进行耐药性测定时,推荐用粪肠球菌ATCC29212或等效菌株作质控菌株。
E.4.3 微量稀释板的制备
E.4.3.1 抗菌药物种类及配制
试验用抗菌药物种类、浓度范围和配制方法见表E.2。
表E.2 试验用抗菌药物及配制a
抗菌药物所属类别
浓度范围
μg/mL
溶剂b 稀释剂c
庆大霉素氨基糖苷类0.5~256 水水
卡那霉素氨基糖苷类2~1024 水水
链霉素氨基糖苷类0.5~256 水水
四环素四环素类0.125~64 水水
红霉素大环内酯类0.016~8 95%乙醇或冰乙酸d 水
克林霉素林可酰胺类0.032~16 水水
氯霉素氯霉素类0.125~64 95%乙醇水
氨苄西林青霉素类0.032~16 0.1mol/L的磷酸盐缓
冲液,pH=8.0
0.1mol/L的磷酸盐缓冲液,
pH=8.0
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表E.2 试验用抗菌药物及配制a(续)
抗菌药物所属类别
浓度范围
μg/mL
溶剂b 稀释剂c
万古霉素糖肽类0.25~128 水水
环丙沙星喹诺酮类0.25~128 水水
泰利菌素大环内酯类0.5~256 冰乙酸d 水
黏菌素脂肽类0.25~128 水水
磷霉素磷霉素类1~512 水水
a 表中涉及的溶剂和稀释剂可根据相关资料进行适当调整。
b 用于溶解粉末状抗菌药物的溶液。
c 用于稀释抗菌药物溶液的试剂。
d 使用冰乙酸做溶剂时,先加1/2体积的水做溶剂,然后逐滴加冰乙酸直至药物溶解,并用水补充至所需体积。
E.4.3.2 微量稀释板中抗菌药物布局
微量稀释板中抗菌药物布局见表E.3。
表E.3 微量稀释板中抗菌药物布局
A 板
单位为微克每毫升(μg/mL)
抗菌药物1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12b
庆大霉素P 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
卡那霉素c P 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 N
链霉素P 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
四环素P 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 N
红霉素P 0.016 0.032 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 N
克林霉素P 0.032 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 N
氯霉素P 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 N
氨苄西林P 0.032 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 N
a P代表阳性对照孔,不添加任何抗菌药物,只添加待测菌悬液和含有用于溶解抗菌药物溶剂(最高浓度)的培
养基。
bN代表阴性对照孔,既不加抗菌药物也不加待测菌株,只添加培养基。
c对屎肠球菌而言,所使用的卡那霉素质量浓度范围为4μg/mL~2048μg/mL。
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表E.3 微量稀释板中抗菌药物布局(续)
B板
单位为微克每毫升(μg/mL)
抗菌药物1a 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12b
万古霉素P 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
环丙沙星P 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
泰利霉素P 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 N
黏菌素P 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 N
磷霉素P 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 N
a P代表阳性对照孔,不添加任何抗菌药物,只添加待测菌悬液和含有用于溶解抗菌药物溶剂(最高浓度)的培
养基。
b N代表阴性对照孔,既不加抗菌药物也不加待测菌种,只添加培养基。
c 对屎肠球菌而言,所使用的卡那霉素质量浓度范围为4μg/mL~2048μg/mL。
E.4.3.3 抗菌药物储备液的制备
所配制抗菌药物储备液的浓度可根据其溶解性而定,但质量浓度至少应在1024μg/mL以上。储
备液应按表E.2要求选用适宜的溶剂,稀释制备成适宜浓度的工作液。如需对储备液进行灭菌处理,可
使用无菌滤膜过滤除菌,同时在过滤前后进行比对试验,以确保不出现滤膜吸附抗菌药物而降低药效的
现象。所有的抗菌药物储备液均应现用现配,特殊情况(如需要特殊储存条件以确保储备液的稳定性)
除外。
E.4.3.4 所需抗菌药物质量或稀释液体积的计算
使用以下公式来计算所需抗菌药物的质量(式E.1)或稀释液体积(式E.2):
m =V ×ρ
P …………………………(E.1)
V =m ×P
ρ …………………………(E.2)
式中:
m ———抗菌药物(粉状)的质量,单位为克(g);
V ———稀释液的体积,单位为升(L);
ρ ———储备液的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
P ———抗菌药物的效力,单位为毫克每克(mg/g)。
E.4.3.5 2倍质量浓度抗菌药物工作液的制备
以庆大霉素为例,将抗菌药物储备液按照表E.4要求进行稀释,分别制备系列2倍质量浓度庆大霉
素工作液。
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GB31615.2—2025
表E.4 2倍质量浓度庆大霉素工作液的制备
步骤庆大霉素溶液
庆大霉素溶液质量浓度
μg/mL
吸取体积
mL
庆大霉素溶液稀释剂
2倍质量浓度庆大霉素工作液
μg/mL
1 庆大霉素储备液5120 1 9 512
2 步骤1终溶液512 1 1 256
3 步骤1终溶液512 1 3 128
4 步骤1终溶液512 1 7 64
5 步骤4终溶液64 1 1 32
6 步骤4终溶液64 1 3 16
7 步骤4终溶液64 1 7 8
8 步骤7终溶液8 1 1 4
9 步骤7终溶液8 1 3 2
10 步骤7终溶液8 1 7 1
参照表E.4的方法,分别制备表E.3中其他抗菌药物系列2倍质量浓度的工作液。
E.4.3.6 制板
以庆大霉素为例,按照表E.3中A 板的布局,分别移取50μL质量浓度为512μg/mL、256μg/mL、
128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL的2倍质量浓
度庆大霉素工作液,加到96孔标准微孔板庆大霉素所在行对应的第11、10、9、8、7、6、5、4、3和2孔中。
按此做法依次将其他待测抗菌药物的系列2倍质量浓度工作液分别加至相对应的微孔板中,备用。制
备好的抗菌药物微量稀释板应尽快使用,如不能及时使用,应将其密封并在低于-20 ℃条件下保存。
微量稀释板中的抗菌药物在低于-20 ℃条件下可稳定保存数月。保存期间可用质控菌种检测其稳
定性。
E.4.4 待测菌悬液的制备
挑取E.4.1中经复苏、活化后在培养基上生长良好的待测菌种新鲜菌落,用比浊仪于盛有2mL~
5mL无菌生理盐水的玻璃试管中制成1.0麦氏浊度菌悬液,或用分光光度计在625nm 波长下测定其
吸光度(OD值),使OD值范围为0.16~0.20。此时,菌悬液中菌的浓度约为3×108 CFU/mL。由于唾
液链球菌嗜热亚种和德氏乳杆菌的某些株可能出现1.0麦氏浊度菌悬液中菌的浓度低于3×108 CFU/mL
的现象,在此情况下应调整麦氏浊度稍高于1.0,确保菌浓度达3×108 CFU/mL时方可使用。对于双
歧杆菌而言,应使用提前一天置于厌氧环境中的LSM-半胱氨酸培养基来制备菌悬液,其他细菌菌悬液
的制备参照CLSI中相近种属进行。
E.4.5 菌悬液接种
依受试菌种不同,选择表E.5推荐的相应培养基将E.4.4中制备好的菌悬液稀释500倍后,依次加
至E.4.3.6制备好的抗菌药物微量稀释板中,每孔50μL。冷冻保存的抗菌药物微量稀释板使用前应置
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GB31615.2—2025
于厌氧条件下快速融化后方可使用。如使用包被有抗菌药物的商品化微量稀释板,则选用表E.5中推
荐的培养基,将E.4.4中制备好的菌悬液稀释1000倍后加至商品化抗菌药物微量稀释板中,每孔100μL。
整个接种过程应在30min内完成。
表E.5 不同菌种进行抗菌药物耐药性测定用培养基和培养条件
中文名称培养基
培养温度
℃
培养条件
培养时间
h
双歧杆菌属LSM-半胱氨酸培养基36±1 厌氧48
短乳杆菌LSM 培养基28±1 厌氧48
植物乳植杆菌/戊糖乳杆菌LSM 培养基28±1 厌氧48
清酒广布乳杆菌LSM 培养基28±1 厌氧48
其他与乳杆菌属培养条件相似的细菌LSM 培养基36±1 厌氧48
乳酸乳球菌IST培养基32±1 厌氧48
唾液链球菌嗜热亚种IST乳糖培养基36±1 厌氧48
屎肠球菌CAMHB培养基36±1 需氧48
注:对双歧杆菌进行耐药性测定时,建议在试验前一天将试验用培养基提前置于厌氧环境中平衡,其他细菌进行
抗菌药物耐药性测定时,可参照相近种属的细菌所用方法操作。
E.4.6 培养
将接种菌悬液后的微量稀释板于表E.5所推荐的相应条件下培养。培养时微量稀释板不宜堆放过
高,以确保每块微量稀释板在相同的温度、湿度、通气量等条件下培养。
E.4.7 结果读取
E.4.7.1 微量稀释板培养48h后,记录每种抗菌药物完全抑制待测菌种生长的MIC。
E.4.7.2 结果记录前,应首先检查阳性对照孔和阴性对照孔,若阳性对照孔细菌生长良好、阴性对照孔
无细菌生长且质控菌种对所有抗菌药物的MIC值均在质控范围内,则各抗菌药物对待测菌种的MIC
值结果可信,否则结果不可信,应重复试验。
E.4.7.3 若出现待测菌种不连续(或间断)生长的情况,则结果不可信,应重复试验。
E.4.8 结果判定
参照表E.6列出的折点值,报告待测菌种对受试抗菌药物的敏感(低于或等于折点值)或耐药(高于
折点值)结果。
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表E.6 不同抗菌药物对相关菌种的折点值
单位为微克每毫升(μg/mL)
菌种名称氨苄西林万古霉素庆大霉素卡那霉素链霉素红霉素克林霉素四环素a 氯霉素环丙沙星泰利霉素黏菌素磷霉素
专性同型发酵乳杆菌b 2 2 16 16 16 1 4 4 4 n.r. n.r n.r n.r
嗜酸乳杆菌群1 2 16 64 16 1 4 4 4 n.r. n.r n.r n.r
专性同型发酵乳杆菌c 2 n.r. 16 64 64 1 4 8c 4 n.r. n.r n.r n.r
罗伊氏粘液乳杆菌2 n.r. 8 64 64 1 4 32 4 n.r. n.r n.r n.r
兼性厌氧异型乳酸菌d 4 n.r. 16 64 64 1 4 8 4 n.r. n.r n.r n.r
植物乳植杆菌/戊糖乳杆菌2 n.r. 16 64 n.r 1 4 32 8 n.r. n.r n.r n.r
鼠李糖乳酪杆菌4 n.r. 16 64 32 1 4 8 4 n.r. n.r n.r n.r
干酪/副干酪乳酪杆菌4 n.r. 32 64 64 1 4 4 4 n.r. n.r n.r n.r
双歧杆菌属2 2 64 n.r. 128 1 1 8 4 n.r. n.r n.r n.r
片球菌属4 n.r. 16 64 64 1 1 8 4 n.r. n.r n.r n.r
明串珠菌属2 n.r. 16 16 64 1 1 8 4 n.r. n.r n.r n.r
乳酸乳球菌2 4 32 64 32 1 1 4 8 n.r. n.r n.r n.r
唾液链球菌嗜热亚种2 4 32 n.r. 64 2 2 4 4 n.r. n.r n.r n.r
芽胞杆菌属n.r. 4 4 8 8 4 4 8 8 n.r. n.r n.r n.r
丙酸杆菌属2 4 64 64 64 0.5 0.25 2 2 n.r. n.r n.r n.r
屎肠球菌2 4 32 1024 128 4 4 4 16 n.r. 4 n.r n.r
棒状杆菌属和其他革兰氏阳性菌1 4 4 16 8 1 4 2 4 n.r. n.r n.r n.r
肠杆菌科8 n.r. 2 8 16 n.r. n.r. 8 n.r. 0.06 n.r 2 8
注1:n.r.不需要。
注2:表中未列出的菌,若是革兰氏阳性菌,可参考棒状杆菌和其他革兰氏阳性菌判定;若是革兰氏阴性菌,可参考肠杆菌科判定,产生的MIC值应与相关菌种公开的
和/或自行研究产生的折点值进行比较。
注3:折点值应该与已经发表的、有关该种或相关种已发表的文献数据进行比对。
注4:当折点值发生更新时,折点值的判定应以更新后的最新折点值为准。
a 对布氏乳杆菌而言,四环素的折点MIC值为128μg/mL。
b 包括德氏乳杆菌和瑞士乳杆菌。
c 包括发酵粘液乳杆菌。
d 包括同型发酵的唾液联合乳杆菌
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E.4.9 质控菌株的质控标准
试验用质控菌株的MIC值应在规定范围内,具体见表E.7。
表E.7 质控菌株MIC值的质控范围
单位为微克每毫升(μg/mL)
抗菌药物
副干酪乳酪杆菌
ATCC334
植物乳植杆菌
ATCC14917
长双歧杆菌长
亚种
ATCC15707
乳酸乳球菌
乳亚种ATCC
19435
唾液链球菌
嗜热亚种
LMG18311
庆大霉素1~4 — 4~32 0.5~2 0.5~4
卡那霉素16~64 — 64~512 2~8 8~32
链霉素8~32 — 8~64 2~16 2~16
四环素1~4 8~32 0.5~2 0.5~2 0.25~2
红霉素0.06~0.5 0.25~2 0.03~0.25 0.12~0.5 0.06~0.25
克林霉素0.06~0.25 0.5~4 0.03~0.12 0.25~1 0.03~0.25
氯霉素2~8 4~16 0.5~4 2~16 2~8
氨苄西林0.5~2 0.25~2 0.25~1 0.12~1 0.03~0.25
万古霉素— — 0.5~2 0.25~1 0.25~1
环丙沙星1~4 16~64 4~16 4~16 1~8
泰利霉素a — — — — —
黏菌素a — — — — —
磷霉素a — — — — —
注:“—”表示不适用。
a 可参考相关资料进行质控。
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GB31615.2—2025
附 录 F
食品用真菌产真菌毒素能力测定方法
F.1 范围
本方法规定了食品用真菌产真菌毒素能力的测定方法。
本方法适用于食品用真菌在试验条件下的产毒能力的测定,对培养物中毒素的测定,按照我国、国
际组织及相关国家规定的标准检测方法进行。
F.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备与材料如下。
F.2.1 恒温培养箱:温度范围(5℃±1℃)~(42℃±1℃)。
F.2.2 电子天平:感量分别为0.1g和0.001g。
F.2.3 锥形瓶:容量为250mL、500mL、1000mL。
F.2.4 显微镜:10×~100×。
F.2.5 微量移液器及配套吸头:量程为100μL~1000μL。
F.2.6 生物安全柜。
F.2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
F.2.8 无菌量筒:容量100mL~1000mL。
F.2.9 温湿度计。温度计允许误差:±1℃,湿度计允许误差:±3% RH。
F.2.10 接种针。
F.2.11 分离针。
F.2.12 无菌试管:16mm×160mm。
F.2.13 无菌培养皿:直径90mm。
F.2.14 载玻片。
F.2.15 盖玻片。
F.3 培养基及其制备
对能够产生毒素的食品用真菌菌种,应在多种基质和条件下(单品种固体、多品种固体复合、不同成
分液体组合等)进行产毒试验,并进行有毒活性代谢产物真菌毒素含量的检测。
F.3.1 菌种活化用固体培养基
F.3.1.1 麦芽汁琼脂:同B.3.2。
F.3.1.2 马铃薯葡萄糖琼脂:同B.3.3。
F.3.1.3 查氏培养基:商品化培养基按照产品说明配制,加热充分溶解后分装,121 ℃高压灭菌15min
后备用。
F.3.2 产毒用培养基
以下培养基中F.3.2.1~F.3.2.7为液体培养基,F.3.2.8~F.3.2.11为固体培养基。
F.3.2.1 查氏酵母提取物(浸粉)培养基:K2HPO41g、10倍查氏浓缩液10mL、酵母提取物(浸粉)5g、
蔗糖30g,用1000mL蒸馏水溶解后,分装至250mL锥形瓶中,每瓶100mL,121℃高压灭菌15min
后备用。
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GB31615.2—2025
F.3.2.2 查氏酵母提取物(浸粉)再加2%蔗糖培养基:K2HPO41g、10倍查氏浓缩液10mL、酵母提取
物(浸粉)5g、蔗糖50g,用1000mL蒸馏水溶解后,分装至250mL锥形瓶,每瓶100mL,121℃高压
灭菌15min后备用。
F.3.2.3 查氏酵母提取物(浸粉)加0.5% NaCl培养基:K2HPO41g、10倍查氏浓缩液10mL、酵母提取物
(浸粉)5g、蔗糖30g、NaCl5g,用1000mL蒸馏水溶解后,分装至250mL锥形瓶,每瓶100mL,121℃
高压灭菌15min后备用。
F.3.2.4 大米粉玉米浸出液培养基(ricecornsteepmedium,RC):大米粉5g、玉米浸出液4g、ZnSO4·
7H2O0.001g、CuSO4·5H2O0.05g,用1000mL蒸馏水溶解后,分装至250mL锥形瓶,每瓶100mL,
121℃高压灭菌15min后备用。
F.3.2.5 马铃薯葡萄糖肉汤培养基:按产品说明书要求称取商品化马铃薯葡萄糖肉汤培养基,加入
1000mL蒸馏水溶解后分装至250mL锥形瓶,每瓶100mL,121℃高压灭菌15min后备用。
F.3.2.6 酵母提取物(浸粉)蔗糖(yeastextractsucrose,YES)液体培养基:酵母提取物(浸粉)10g、蔗
糖50g,用1000mL蒸馏水溶解后,调节pH 至7.0,分装至250mL锥形瓶,每瓶100mL,121℃高压灭
菌15min后备用。
F.3.2.7 麦芽汁培养基:取未经发酵、未加酒花的啤酒生产用麦芽汁,分装至250mL锥形瓶中,每瓶
100mL,121℃高压灭菌15min后备用。
F.3.2.8 大米培养基:取大米20g,置于500mL或1000mL锥形瓶中,根据不同菌种产生毒素的湿度
要求,用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数值视菌株产毒特性要求而异),121℃高压灭菌20min,
冷却后手心击拍瓶体将结块的米粒打散,之后每日121℃高压灭菌20min1次,连续灭菌3d,每次高
压灭菌冷却后均应拍击打散,备用。
F.3.2.9 玉米培养基:取粉碎后的玉米渣20g(粒径0.2mm~0.5mm)至500mL或1000mL锥形瓶
中,根据不同菌种产生毒素的湿度要求,用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数据视菌种产毒特性
要求而异),121℃高压灭菌20min,冷却后手心击拍瓶体将结块的玉米渣粒打散,之后每日121℃高压
灭菌20min1次,连续灭菌3d,每次高压灭菌冷却后均应拍击打散,备用。
F.3.2.10 麦麸培养基:取麦麸20g至500mL或1000mL锥形瓶中,根据不同菌种产生毒素的湿度要
求,用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数据视菌种产毒特性要求而异),121℃高压灭菌20min,冷
却后手心击拍瓶体将结块的麦麸打散,之后每日121℃高压灭菌20min1次,连续灭菌3d,每次高压
灭菌冷却后均应拍击打散,备用。必要时可用全麦粒替代麦麸进行产毒试验。
F.3.2.11 固体复配培养基:大米、玉米渣、麦麸(或全麦粒)以1∶1∶1比例混合后,取20g至500mL
或1000mL锥形瓶中,根据不同菌种产生毒素的湿度要求,用蒸馏水调整培养基的水分及pH(具体数
据视菌种产毒特性要求而异),121℃高压灭菌20min,冷却后手心击拍瓶体将结块的培养基打散,之后
每日121℃高压灭菌20min1次,连续灭菌3d,每次高压灭菌冷却后均应拍击打散,备用。
在对菌种进行产毒试验时,所选的产毒培养基除了生产用基质外,还应从以上所列培养基中至少选
择3种液体培养基、3种固体培养基和含有3种固体培养基成分的固体复配培养基。
F.4 操作步骤
F.4.1 产毒试验前对送检菌种的处理
送检菌种必须为纯菌种,转种到适宜的培养基斜面后,28℃±1℃培养5d~7d,确证为活的纯培
养物后方可进行产毒试验。转种用培养基曲霉属一般选用查氏培养基,红曲霉选用麦芽汁琼脂培养基,
其他菌种选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
F.4.2 产毒培养物制备及产毒培养
将送检菌种按照F.4.1要求转种活化后,加5mL无菌蒸馏水于斜面培养基试管中,用接种针刮取
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斜面培养基上的菌丝体和孢子制备孢子悬液,取一定量孢子悬液,分别接种于从F.3.2中选取的所有产
毒培养基中,充分混匀后,置28℃±1℃培养21d(每天将固体/液体培养物振摇、混匀)后,进行真菌毒
素测定。可根据不同菌、不同毒素适宜的产毒条件对试验过程中的温度、湿度、光照、通气量、培养时间
等进行调整。
F.4.3 真菌毒素测定
按照食品安全国家标准规定的相关检测方法或其他等效方法进行真菌毒素的测定。
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