YY/T 1954-2025 重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析

ICS11.040.40
CCS C30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1954—2025
重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析
Peptidemassfingerprintinganalysisofrecombinantcollagen
2025-02-26发布2026-03-01实施
国家药品监督管理局发布
目 次
前言………………………………………………………………………………………………………… Ⅲ
1 范围……………………………………………………………………………………………………… 1
2 规范性引用文件………………………………………………………………………………………… 1
3 术语和定义……………………………………………………………………………………………… 1
4 缩略语…………………………………………………………………………………………………… 1
5 概述……………………………………………………………………………………………………… 1
6 试剂及其配制、仪器……………………………………………………………………………………… 2
7 操作方法………………………………………………………………………………………………… 2
8 测定结果分析…………………………………………………………………………………………… 4
9 报告……………………………………………………………………………………………………… 5
参考文献……………………………………………………………………………………………………… 6
Ⅰ
YY/T1954—2025
前 言
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请 注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家药品监督管理局提出。
本文件由中国食品药品检定研究院归口。
本文件起草单位:四川省药品检验研究院(四川省医疗器械检测中心)、中国食品药品检定研究院、
岛津企业管理(中国)有限公司、中国科学院过程工程研究所。
本文件主要起草人:刘兴兰、高建萍、冀峰、范行良、卢华、赵登位、邢芳毓、黄元礼、赵代国、张贵锋、
李晓东、徐丽明。
Ⅲ
YY/T1954—2025
重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析
1 范围
本文件描述了重组胶原蛋白肽图指纹图谱的分析方法,包括肽图、肽段覆盖率、异质性分析。
本文件适用于重组胶原蛋白的肽图指纹图谱分析。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T6682 分析实验用水规格和试验方法
YY/T1849 重组胶原蛋白
中华人民共和国药典(2020年版)
3 术语和定义
YY/T1849界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
肽图指纹图谱 peptidemassfingerprinting
采用适宜的特异性酶将蛋白质裂解为肽段,经可靠方法分离和鉴定后获得的特征性图谱,它可提供
待测蛋白质的肽段序列信息。
4 缩略语
下面缩略语适用于本文件。
DTT:二硫苏糖醇(Dithiothreitol)
IAA:碘乙酰胺(Iodoacetamide)
HCl:盐酸(Hydrochloricacid)
Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane]
Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[Tris(hydroxymethyl)aminomethanehydrochloride]
5 概述
参照《中华人民共和国药典》(2020年版)中3405,将重组胶原蛋白样品用适宜的蛋白酶酶解(如胰
蛋白酶),用高效液相色谱进行分离获得肽图指纹图谱;利用高效液相色谱-高分辨率质谱技术进行分析
得到多肽一级、二级谱图,然后与理论氨基酸序列酶解肽段匹配,进行胶原蛋白肽段覆盖率分析,用于评
价重组胶原蛋白的符合性。
利用肽图指纹图谱可进行异质性分析。例如,N 端甲硫氨酸,信号肽或前导序列和其他可能的
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N 端、C端修饰,以及各种其他翻译后修饰(如脱酰胺化、氧化、异构化、碎片化、二硫键错配、N-连接和
O-连接的寡糖、糖基化、聚集等),评价产品工艺及其监测工艺的稳定性。
6 试剂及其配制、仪器
6.1 试剂
除特别注明外,所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682的要求。
6.1.1 乙腈、甲酸:用于高效液相色谱-质谱检测时使用质谱纯,用于高效液相色谱检测时使用色谱纯。
6.1.2 胰蛋白酶:序列纯。取20μg的酶加入200μL0.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0)溶解成
0.1μg/μL的溶液(也可按照说明书配制使用)。
6.1.3 0.5%醋酸溶液(V/V):量取0.5mL冰醋酸加水并定容至100mL。
6.1.4 0.1mol/LTris-HCl溶液(pH8.0):称取0.121gTris溶于5mL水中,用6mol/L的盐酸调pH
至8.0,加水定容至10mL,2℃~8℃保存。
6.1.5 8mol/L盐酸胍溶液:称取7.64g盐酸胍,加水溶解并定容至10mL,混匀即得,2℃~8℃保存。
6.1.6 1mol/LDTT溶液:称取0.1542gDTT,加水1.0mL溶解即得,-20℃保存。
6.1.7 1mol/LIAA 溶液:称取0.1849gIAA,加水1.0mL溶解即得,2℃~8℃避光保存。
6.2 仪器
6.2.1 分析天平:精度0.00001g;
6.2.2 离心机;
6.2.3 水浴锅或恒温箱;
6.2.4 涡旋仪;
6.2.5 高效液相色谱仪;
6.2.6 高效液相色谱-质谱仪[例如,液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱仪(LCMS-QTOF)、液相色
谱-静电场轨道阱高分辨质谱仪(LCMS-Orbitrap)等]。
7 操作方法
7.1 供试品溶液制备
7.1.1 不含二硫键供试品溶液制备
7.1.1.1 供试品溶解
不同性状的供试品溶解方法如下:
———固体供试品:称取5mg(精确到0.00001g)重组胶原蛋白供试品置于15mL离心管中,加入
5mL0.1mol/LTris-HCl溶液(pH8.0)溶解;
———液体供试品:取液体供试品适量,置超滤管(10kDa)中,以相对离心力11000g 离心10min,加入
100μL0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液,11000g 离心10min,去掉外层套管中过滤掉的液
体,再次在超滤管中加入100μL0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液,11000g离心10min,去
掉外层套管中过滤掉的液体,重复此操作至外层套管中滤液pH 约为8。保留超滤管中的供
试品,在超滤管中加入100μL0.1 mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液,反复吹打,将溶液吸到
0.5mL的离心管中。蛋白浓度约为1mg/mL。
注:供试品也可以采用其他经验证对异质性无影响的溶剂溶解。
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7.1.1.2 酶解反应
取7.1.1.1中溶解的供试品溶液100μL 置于0.5mL离心管中,加入胰蛋白酶,胰蛋白酶与蛋白的
比例(m/m )为1∶20~1∶50,充分振荡混匀,封口膜封好后于37℃反应一定时间(推荐2h~20h)达
到完全酶解,避免过长时间反应。
7.1.1.3 终止酶解反应
酶解完成后,向酶解样品管中加入10μL10%甲酸(终浓度约为1%),终止酶解反应,待用。
注1:酶解时间根据蛋白理论序列长短及复杂程度进行预实验,确定达到完全酶切,且避免过度酶切的时间。
注2:根据对理论氨基酸分析,采用合适的蛋白酶,常用胰蛋白酶。若胰蛋白酶不适用,可选用其他蛋白酶,如糜蛋
白酶、金黄色葡萄球菌V8酶(Glu-C酶)、赖氨酸蛋白酶(Lys-C酶)等。
7.1.2 含有二硫键的供试品溶液制备
7.1.2.1 供试品溶解
根据供试品的性状不同,按以下方法进行供试品溶解。
———固体供试品:称取5mg(精确到0.00001g)重组胶原蛋白供试品置于15mL离心管中,加入
5mL0.5%醋酸溶液溶解。
———液体供试品:取液体供试品适量,加0.5%醋酸溶液适量,制成蛋白质量浓度约为1mg/mL的
溶液。
7.1.2.2 变性
按以下步骤进行样品变性处理。
a) 取7.1.2.1中溶解的供试品100μL 置超滤管(10kDa)中,加入100μL0.1mol/LTris-HCl
(pH8.0)溶液,以相对离心力11000g 离心10min,去掉外层套管中过滤掉的液体,再次在超
滤管中加入100μL0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液,11000g 离心10min,去掉外层套管中
过滤掉的液体,重复此操作2次,至外层套管中滤液pH 约为8 。保留超滤管中的供试品,加
入100μL8mol/L盐酸胍,在涡旋仪上剧烈震荡15s,静置10min,使样品完全变性,加100μL
0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液,11000g 离心10min,重复2次,去掉外层套管中过滤掉的
液体,保留超滤管中的样品。
b) 在超滤管中加入5μL1mol/LDTT,涡旋混匀后置56℃中反应30min。
c) 冷却至室温后加入13μL1mol/LIAA,放置室温,避光反应30min。
d) 11000g 离心10min,在超滤管中加入100μL0.1mol/LTris-HCl(pH8.0),11000g 离心
10min,重复2次,去掉外层套管中过滤掉的液体,保留超滤管中的供试品。
7.1.2.3 酶解反应
在超滤管中加入100μL0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液,反复吹打,将溶液吸到0.5mL的离心
管中。加入胰蛋白酶,胰蛋白酶与蛋白的比例(m/m )为1∶20~1∶50,充分振荡混匀,封口膜封好后于
37℃反应一定时间(推荐2h~20h)达到完全酶解,避免过长时间反应。
注:含有二硫键还原样品宜现配现用,避免时间过久导致二硫键复连。
7.1.2.4 终止酶解反应
同7.1.1.3。
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7.2 高效液相色谱-质谱测定条件
7.2.1 高效液相色谱法条件
色谱柱:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐PeptideBEH C18300Å1.7μm 2.1mm×
100mm、PeptideCSHC18130Å1.7μm 2.0mm×150mm 、Shim-packArataPeptideC18,2.2μm
2.0mm×150mm、ThermoAccucoreC18 2.6μm2.1mm×150mm)。
流动相:流动相A 为含0.1%甲酸的水溶液,流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液,梯度洗脱,推荐
流动相梯度见表1,可根据不同色谱柱、不同样品进行调节。
流速:根据不同色谱柱的耐受能力选择0.1mL/min~1.0mL/min。
柱温:35℃~60℃。
进样量:根据色谱柱的不同选择1μL ~10μL。
检测波长:214nm。
表1 流动相梯度
时间/min A/% B/%
0 98 2
5 98 2
65 70 30
70 10 90
74 98 2
80 98 2
7.2.2 质谱条件
可根据不同仪器的特点,对操作参数做适当调整,以获得最佳离子化效率。
离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;扫描模式:一级质谱和二级质谱扫描。
8 测定结果分析
8.1 肽图
如采用对照品或参比品作对照图谱,对照品应与供试品按相同方法处理。在高效液相色谱或质谱
记录的色谱图或总离子图中,供试品检出的色谱峰个数和保留时间与对照品基本相同,则可判断供试品
与对照品一致。
注:结构较复杂的样品高效液相色谱图可能不能反映完整的肽图。
8.2 肽段覆盖率
肽段覆盖率是重组胶原蛋白经过蛋白酶酶解后,产生的小分子肽段被(数据处理软件)识别的氨基
酸个数占理论氨基酸总数的比值,以百分比表示。
选用适宜的蛋白质鉴定软件(例如,BioPharmaFinder、UNIFI、Byomap)进行分析。具体操作步骤
如下。
a) 输入理论氨基酸序列建立理论序列数据库。
b) 根据理论氨基酸序列,设置常见的可变修饰。重组胶原蛋白常见的可变修饰,如甲硫氨酸氧
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化修饰(Oxidation:M+15.9949Da)、天冬酰胺脱酰胺化(Deamidated:N+0.9840Da)、谷氨酰
胺脱酰胺化(Deamidated:Q+0.9840Da)、谷氨酰胺的焦谷氨酸化(Gln→pyro-Glu:Q-
17.0265Da)。谷氨酸的焦谷氨酸化(Glu→pyro-Glu:E-18.0105Da)、氮端氨基甲酰化(Carbamyl:+
43.0058Da)、甲硫氨酸脱硫代甲基化(Dethiomethyl:M-48.0033Da)、氮端脱氨化
(Ammonia-loss:-17.0265Da)和氮端乙酰化(Acetyl:+42.0105Da)等。
c) 若样品含有二硫键,并且前处理操作中使用了碘乙酰胺进行半胱氨酸的烷基化,需要设置半胱
氨酸烷基化为固定修饰(Carbamidomethyl:C+57.0214Da)。
d) 打开原始质谱数据。选择酶切方式,蛋白质酶类型为胰蛋白酶时,酶切位点为精氨酸和赖氨
酸,设置最多允许2个漏切位点。设置母离子质量偏差为±百万分之十,二级质谱质量偏差为
±百万分之十。
e) 利用软件分析肽段覆盖率。
注1:对于小于5个氨基酸的肽段如未被软件识别,需要采用其他酶进行酶切处理,单独识别这些肽段,对覆盖率进
行补充说明。例如,胰蛋白酶有2个酶切位点(K,R),采用Lys-C 酶只有1个位点K 进行酶切,肽段会变
长,可以被识别。
注2:根据使用的数据处理软件,设置合适的过滤参数。例如,使用BioPharmaFinder软件(版本号4.1)时,推荐肽
段覆盖率分析时最小可信度(minimumconfidence)设置为0,平均结构分辨率(averagestructuralresolution,
ASR)设置为≤5;异质性分析时最小可信度设置为0.8,平均结构分辨率设置为≤5。
8.3 异质性分析
按以下步骤进行异质性分析:
a) 软件参数设置和操作步骤同8.2a)~d);
b) 分析发现的修饰类型和修饰位点;
c) 计算修饰比例:可以通过蛋白分析软件计算得到,或手工计算。按式(1)计算。
M =
Amp (Amp +Aup)×100% …………………………(1)
式中:
M ———修饰比例;
Amp———修饰后肽段峰面积;
Aup ———未修饰肽段峰面积。
9 报告
报告宜至少包括以下内容:
a) 供试品基本信息;
b) 蛋白酶名称(非标准中推荐的蛋白酶,应同时提供反应体系);
c) 测试仪器名称,测试条件;
d) 分析软件名称,软件分析参数;
e) 测试和分析结果(包括肽图、肽段覆盖率、异质性分析),异质性分析建议以表的形式呈现,至少
包括修饰位点、修饰类型、发生修饰的肽段、修饰比例。
f) 附图:肽图谱图、肽段覆盖率图。
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参 考 文 献
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